脉孢菌中表观遗传修饰复合体介导的甲硫氨酸代谢调控分子机制的研究

本课题利用遗传学与生物化学方法，对脉孢菌中CRL4泛素连接酶和COP9信号体介导的甲硫氨酸合成通路相关酶的转录调控分子机制进行研究。系统研究参与甲硫氨酸代谢调控的转录因子、mediator及相关的表观遗传学修饰，并探讨这些因子与CRL4泛素连接酶和COP9信号体之间的相互作用，确定CRL4泛素连接酶和COP9信号体在哪个层级上进行转录调控。最后系统分析CRL4泛素连接酶和COP9信号体对下游表观遗传修饰的影响。由于上述代谢及相关复合体在真核生物中的保守性，上述研究不但可以增进对真核生物甲硫氨酸代谢调控的认识，同时也为解析表观遗传学修饰的调控机制开拓了新方向。

CRL4（Cullin-RING ligase 4）是真核生物中一类保守的泛素连接酶。研究表明，粗糙脉孢菌中CRL4核心组分Cul4、DDB1及底物募集蛋白DCAF26可参与组蛋白H3K9三甲基化和DNA甲基化修饰的调控，然而具体机制尚不清楚；另一方面，生物信息学预测基因组中存在多个DCAF蛋白，暗示粗糙脉孢菌中CRL4功能的多样性。. 为探索粗糙脉孢菌中CRL4的生物学功能的多样性，我们采用了蛋白质双向电泳及质谱鉴定技术，对野生型菌株及CRL4核心亚基缺失突变体进行蛋白表达的差异分析，发现CRL4参与调控物质与能量代谢、细胞周期、转录、蛋白合成与折叠、细胞应激、信号转导等多个通路中的蛋白，这一结果为以后的深入研究提供了大量线索。. 此外，在CRL4各亚基突变体中，甲硫氨酸合成酶MET-8的蛋白和mRNA水平均显著下调。对met-8基因在基因组上的定位分析发现，met-8基因上游存在异染色质区域，且此区域对met-8基因的高水平表达不可或缺，暗示CRL4DCAF26可能是通过调控组蛋白H3K9三甲基化修饰及异染色质形成促进了met-8基因的转录。同时，为了研究异染色质调控met-8基因表达的分子机制，我们在CRL4亚基及相关突变体中检测了met-8启动子区域RNA Pol II的募集，发现在上述突变体中 RNA Pol II在核心启动子区域的募集量减少，同时伴随着组蛋白H3K4三甲基化修饰水平的降低。上述结果证明，CRL4通过调控met-8基因上游的异染色质区域的建成，促使RNA Pol II在met-8启动子区域的募集及转录活性相关表观遗传修饰的建成，进而调控met-8基因的转录。. 综上所述，本课题通过蛋白质组学方法，结合生化和遗传手段，对粗糙脉孢菌泛素连接酶CRL4的多种功能进行了初步探索，并对其调控染色体上甲基化修饰的机制进行了深入研究，为异染色质的建成机制及异染色质调控基因转录的特殊方式提供了重要的参考。