基于CRISPR/Cas9技术的NAC4与NAC9调控番茄成熟衰老差异模式

Based on the previous study of the research group, we found that VIGS-silenced NAC4 and NAC9 tomato fruits showed opposite fruit softening tendency. This project will use the GUS in vivo method to identify promoters, construct NAC4 and NAC9 promoter deletion fragments, and detect them by GUS staining and GUS contents. The ripening regulatory promoter elements of SNAC4 and 9 will be identified; on this basis, CRISPR/Cas9 NAC4 and NAC9 single genes and polygene-silenced transgenic SNAC tomato (including promoter regions) were obtained using advanced gene editing technology- CRISPR technology. Genetic and protein levels will be systematically analyzed for changes in pigment metabolism, cell wall metabolism, and hormone levels; the patterns of NAC4 and NAC9 regulation of tomato ripening; and the relationships with hormones ethylene, ABA, JA, and SA. The research results of the project will help to reveal the regulatory mechanisms of different genes in the tomato NAC family of transcription factors during ripening and senescence, explore in depth the clear mechanism of NAC regulating fruit maturation and senescence, and enrich the theory of application of the CRISPER gene editing technology in postharvest research.

基于课题组前期研究发现VIGS沉默NAC4与NAC9的番茄果实表现出相反的果实软化趋势，本项目首先采用GUS体内鉴定启动子的方法，构建NAC4和NAC9 promoter deletion 载体， 通过GUS staining 和GUS含量检测， 确定SNAC4和9的调控成熟的启动子元件；在此基础上利用先进的基因编辑技术CRISPR技术，获得CRISPR/Cas9 NAC4和NAC9 单基因和多基因沉默的转基因SNAC番茄（包括启动子区域），在基因和蛋白水平上系统分析色素代谢、胞壁代谢和激素水平变化规律；明确NAC4和NAC9 的调控番茄成熟差异模式；以及与激素乙烯、ABA、JA、SA关系。项目的研究成果有助于揭示番茄果实NAC转录因子家族不同基因在成熟衰老中的调控机制，深入探索明确NAC调控果实成熟衰老机制，同时丰富CRISPER基因编辑技术在采后研究领域的应用理论。

NAC转录调节因子在番茄成熟过程中起重要作用。病毒诱导的SNAC4（SlNAC48，基因ID: 101247735）和SNAC9（SlNAC19，基因ID: 101248665）基因沉默影响番茄成熟，SNAC4/9参与乙烯和脱落酸（ABA）代谢途径。然而，SNAC4/9调控番茄果实成熟衰老差异尚不清楚。CRISPR/Cas9技术目前已成功应用于番茄、拟南芥和水稻等作物以诱导有价值的性状，在番茄中的应用主要集中在果实品质提高、品种驯化以及对生物和非生物胁迫抗性等方面。.为系统研究SNAC4和SNAC9在番茄成熟衰老进程中的精准功能，设计SNAC4/9敲除靶点，通过重叠聚合酶链式反应（Overlapping PCR）法构建单引导RNA（single-guide RNA，sgRNA）表达盒，采用Golden Gate克隆方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体，PCR和测序结果表明成功构建SNAC4/9敲除单靶点和多靶点载体。通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞。通过鉴定T1代突变体进一步证明CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。基于CRISPR/Cas9技术的SNAC4/9基因敲除模型，我们发现敲除组果实色素积累延迟。筛选了稳定遗传的SNAC9突变体，探索了SNAC9参与番茄成熟过程色素代谢的机制。结果表明，SNAC9敲除突变体果实成熟延迟，SNAC9突变体显著影响类胡萝卜素代谢；突变体的叶绿素降解率、类胡萝卜素总量和番茄红素含量均显著降低；叶绿体向色质体的转化减慢；改变了番茄成熟过程中参与色素代谢的关键基因的表达；SNAC9敲除还改变了参与乙烯和ABA生物合成的关键基因的表达水平；SNAC9通过直接调控PSY1、DXS2、SGR1和CrtR-b2来调控类胡萝卜素代谢；SNAC4与胞壁代谢关键基因XTH1和LOXB互作。.本研究为番茄成熟网络的建立和番茄成熟调控的精准化奠定了基础。研究结果有利于今后番茄果实成熟衰老预测和品质改良等方面的研究和运用，同时丰富了CRISPR基因编辑技术在采后研究领域的应用理论。