基于VIGS的番茄成熟衰老、乙烯相关的NAC转录因子的分离与功能分析

NAC 是植物所特有的一类转录因子，目前在其他真核生物中尚未发现其同源物。它被认为是植物基因组中最大的转录因子家族之一，是近十年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转录因子。课题以番茄果实为研究材料，克隆番茄NAC转录因子基因，系统研究NAC转录因子对番茄发育和成熟衰老的调节作用；利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）研究番茄果实中表达增强的乙烯信号转导转录因子（LeEILs和LeERF1/LeERF2）和乙烯合成关键基因（LeACS2/ LeACS4）对NAC转录因子的调控模式，确定NAC转录因子在番茄成熟衰老进程中的作用，揭示系统II 乙烯对NAC转录因子的调控机理，探明乙烯合成和信号通路转录因子差异性调控衰老转录因子NAP的模式，进一步明确乙烯在转录水平上调控果实采后成熟衰老的机制，同时为VIGS技术在果实成熟衰老研究中的应用提供科学依据。

NAC家族转录因子是植物特有的转录调控因子，在植物的生长发育、胁迫应答过程中发挥重要的作用，是当前植物基因功能及表达网络调控研究中的热点。目前对于NAC转录因子在果实成熟衰老中的作用和调控模式尚不清楚，因此课题从番茄中分离和研究NAC转录因子基因功能具有重要的意义。.项目首先利用生物信息学方法分析番茄NAC转录因子的结构与特性。通过QPCR方法研究其在不同组织、不同成熟阶段、不同成熟类型果实和外源激素处理下的表达特性。同时利用VIGS技术沉默目的基因，深入阐明NAC对乙烯合成和信号通路中相关基因的作用。项目还研究了番茄幼苗在短期非生物胁迫、外源激素，及长期非生物胁迫、外源激素处理下番茄幼苗中SNAC4-9表达水平，丰富了NAC的胁迫应答功能。 .主要研究成果如下：.(1)生物信息学分析。在番茄全基因组中分离74个NAC转录因子（SlNAC1-74），对其基因和编码蛋白的结构和理化性质进行分析，并预测其生物功能。.(2)基因表达分析结果表明SNAC4-9基因参与番茄的生长发育和成熟衰老进程，在番茄果实中具有差异表达特性。外源ABA、SA和乙烯处理一定程度促进SNAC基因的表达，NAC转录因子在乙烯通路中受到RIN、Gr蛋白的调控作用。结果暗示SNAC基因通过乙烯信号传导途径参与对番茄果实成熟发育的调控过程。.(3)胁迫反应综合分析表明，SNAC4-9广泛参与多种非生物胁迫的应答，SNAC4-9可能为ABA、SA和MeJA依赖型基因，通过ABA、SA和MeJA信号转导途径参与植物的胁迫应答。.(4)VIGS技术分析NAC与乙烯之间关系。成功构建TRV-SNAC重组病毒载体，并应用VIGS技术沉默番茄果实中SNAC4/5/6/7/9基因，果实呈现出延迟成熟的表型。发现SNAC基因的沉默导致番茄果实中乙烯合成和信号传导途径中相关基因表达丰度的变化，LeACS2、LeACO1、LeEIL和NR基因表达受到抑制作用，而LeERF和LeRIN基因表达量提高，其中SNAC9调控效果显著。此外，沉默LeACS4, LeACO1和LeERF2基因下调SNAC4和SNAC9表达，而沉默NR基因，上调SNAC9的表达。结果表明SNAC转录因子与乙烯路径中相关基因存在互作关系，是番茄果实成熟衰老的重要调控因子。