基于核酸酶反应的生物模拟核酸适配体筛选技术研究

Aptamers hold great promise in biosensing and biomedical fields. One of the major obstacles that prevent the wide applications of aptamers is the lack of rapid and highly efficient aptamer selection approaches. We recently reported that the aptamer-target complex can resist the digestion of various nucleases. Based on our previous work on developing aptamer selection methods (PNAS, 2009, 2010), we proposed here a nuclease reaction-based method for the selection of aptamers, called Enzymatic-SELEX. The core novelty of the proposed method is that by mimicking biological system, the unbounded DNA sequences are digested by nuclease and only the oligonucleotides that bound with the target molecules are survived for the next cycle of selection. This method, simple for operation and low-cost, doesn't require any instruments for separation and doesn't need to immobilize target onto the solid phase as well. In addition, the use of primer-free DNA pool in the selection can eliminate the interference of PCR primer regions on target binding, improve post selection efficiency in identifying aptamer-target binding regions. The method proposed here would make important contribute to the development of aptamer selection technology, sensing technology, and disease diagnostic and treatment technologies.

核酸适配体(aptamer)在生物传感和生物医学领域具有重要的应用价值。缺乏快速高效的筛选技术是制约其广泛应用的最主要原因之一。我们近期的研究发现aptamer与靶标的复合物可以很好地抵制多种核酸酶降解（AC，2012）。同时基于我们在适配体筛选技术方面的经验和发现的问题（PNAS，2009，2010），本项目提出一种基于核酸酶反应的aptamer筛选新方法（Enzymatic -SELEX）。其核心创新点是模拟生物体系，利用核酸酶的结构选择性将不能与靶标结合的单链DNA链降解，只有与靶标结合的aptamer进入下一循环的筛选。该技术无需任何分离设备，且无需将靶标或文库进行固相固定，操作简单廉价。此外采用无引物文库，消除引物区对筛选影响，有利于大幅提后筛选过程中aptamer结合区域分析的效率。本项目将对发展我国具有自主产权的适配体筛选技术、生物传感技术及疾病诊断与治疗技术有着重要意义。

核酸适配体在生物传感和生物医学领域具有重要应用价值。缺乏高效的筛选技术是制约其广泛应用的主要原因之一。固相筛选技术是目前核酸适配体筛选的常用技术，该技术需要将靶标或文库固定于固相基质。由于固相界面对筛选进程的难以预计的影响，往往导致筛选失败。如何提高筛选效率是目前核酸适配体筛选技术的研究重点和难点。本研究先后从不同的角度研究探索了这一关键性科学问题。（1）探索了基于核酸酶的无需靶分子固相固定的均相核酸适配体筛选新方法的可行性，取得了阶段性成果（Biotechniques, 2014,授权专利，入选2014年最有趣和有用的PCR技术进展），但是研究表明基于无引物区的均相核酸适配体筛选方法存在步骤复杂，核酸酶的结构选择性难以优化的缺点。（2）核酸适配体与靶分子的特异性的分子识别是核酸适配体筛选成功与否的基础。我们系列研究了影响核酸适配体特异性分子识别的多种因素：核酸适配体在界面上的构象及其控制（Anal. Chem. 2014; ACS Appl. Mater. Interfaces 2016）、核酸适配体在界面组装方式（Electrochimica Acta 2015）、核酸适配体的界面集合效应（Anal. Chem. 2015）、溶剂效应（Anal. Bioanal. Chem. 2016）、界面非特异性吸附影响等。研究成果为核酸适配体筛选条件的选择和优化提供了基础。（3）结合上述研究成果，成功进行了邻苯二甲酸酯类增塑剂（PAE）DNA核酸适配体的快速筛选，所筛选出来的核酸适配体具有高的亲和力（nM级别）和选择性（1000000以上）。基于该核酸适配体构建了高灵敏和特异性的电化学传感器，检出限低于10 pM。PAE是我国和世界上污染最为广泛的一类持续性有机污染物，本研究成果为环境和食品中PAE的快速检测方法的建立提供了重要基础。综上所述，本项目围绕核酸适配体的筛选与应用开展了多角度的研究，多项研究成果具有良好的应用前景和科学价值。另外由于核酸适配体筛选技术研究的复杂性，部分研究尚在进行中，预期成果将积极推动核酸适配体筛选技术的进展。