聚乙烯醇间隔链协助的DNA-纳米金快速和构象可控的制备方法研究

The conformation controllable preparation of DNA gold nanoparticle complexes (DNA-AuNP) is one of the major obstacles that prevent the practical applications of biosensing technologies. We recently found that the polyethylene glycol (PEG) spacer can substantially speed up the immobilization kinetics of the thiolated single stranded DNA on AuNP and the loading capacity achieved in 2 h was even higher than that obtained via the classical “aging-salting” method in 2 d. Based on our previous work on the study of self-assembly kinetics of thiolated single stranded DNA on AuNP (AC, 2014, 2015), we proposed here a PEG spacer assisted method for the rapid and conformation-controllable preparation of DNA-AuNP, call PEGSA. In PEG-SA, the DNAs with the ideal conformation are directly immobilized on AuNPs in a facile and rapid way. This method avoids the uncontrollable hybridization and conformational changes on the surfaces of AuNPs and the need to use surface active molecules to enhance the salt tolerance of AuNP. The method proposed here would make important contribute to the development of in vitro diagnostic products.

DNA-纳米金复合物（DNA-AuNP）的构象可控的制备是生物传感技术实现产业化所面临的一个技术难题。我们近期发现聚乙烯醇（PEG）间隔链大幅提高巯基修饰DNA在AuNP上的自组装动力学, 2个小时就获得比2天的经典“老化加盐”法还高的DNA上载量。同时基于我们在巯基修饰DNA在AuNP上自组装动力学研究的经验和发现的问题（AC，2014，2015），建立一种PEG间隔链协助的DNA-AuNP快速和构象可控的制备方法（PEG-SA），用于单链DNA-AuNP、分子信标DNA-AuNP、双链DNA-AuNP和三链DNA-AuNP的制备。PEG-SA直接将具有理想二级结构的DNA组装在AuNP上，简单、快速地实现构象可控的DNA-AuNP的制备。既避免了界面上难于控制的杂交和构象变化，也无需使用表面活性分子来提高AuNP盐耐受能力。本项目对发展我国具有自主产权的体外诊断产品有重要意义。

DNA-纳米金复合物（DNA-AuNP）的构象可控的制备是生物传感技术实现产业化所面临的一个技术难题。本项目以解决该问题为起点，建立了基于寡乙二醇间隔链协助的DNA-AuNP快速和构象可控的制备方法，成功用于单链DNA-AuNP、分子信标DNA-AuNP、G四聚体DNA-AuNP、Tween 80包被的DNA-AuNP的制备。在项目的实施过程中我们发现基于Au-S配位键相互作用的DNA-AuNP制备方法还存在长期存储和功能稳定性差的问题。为此我们系统研究了影响DNA-AuNP长期存储和功能稳定性的因素，并发现了AuNP的多重催化活性和Au-S配位键易于氧化是DNA-AuNP长期存储和功能稳定性差的根本原因。常规的界面封闭无法从根本上解决DNA-AuNP长期存储和功能稳定性差的问题，需要发展全新的自组装化学来避免这些问题。围绕生物大分子的界面吸附行为的特点，以及界面固定对生物分子分子识别能力的巨大影响，我们将研究内容充分拓展，成功解决了核酸适配体从体外筛选、亲和力鉴定，二级结构设计到生物传感器应用全产业链条所面临的部分核心技术问题。构建了均相核酸适配体体外筛选新方法（MCP-SELEX），避免复杂的界面干扰，3-5轮筛选即可获得具有nM亲和力的核酸适配体；利用pH调控靶标在纳米金界面上的吸附能力，实现均相条件下对核酸适配体解离常数的测定（Nano-Affi）,是目前为止唯一灵敏度达到nM的高通量解离常数测定技术；提出了一种基于G四聚体结构的结构开关型核酸适配体的工程化设计方法（G4-SSA），为具有普适性的结构开关型核酸适配体的工程化提供了一种有效的解决方案；通过界面封闭解决了基于链取代的电化学传感器对憎水性靶标适用性差的问题；通过调控核酸适配体的探针密度，实现对流感病毒电化学阻抗传感器灵敏度和特异性的调控；利用表面活性剂来原位激活小鼠脑组织切片上蛋白的构象，将蛋白质成像的检测通量提升一个数量级以上。以上研究成果对于推进DNA-AuNP复合物在IVD领域的产业化应用；推进核酸适配体研究领域进展；实现其在分析测试领域的应用均具有重要科学与实际应用价值。