谷氨酸棒杆菌MFS木糖转运蛋白研究

In Corynebacterium glutamicum, xylose translocates through the membrane mainly via glucose-specific PTS system, thus the inhibition of xylose translocation by glucose is the bottleneck of simultaneous consumption of glucose and xylose. Meanwhile there is another xylose translocation pathway: the major facilitator superfamily protein, which is currently unknown. The detailed study of the MFS xylose transporter would provide a way to solve the problem of simultaneous utilization of glucose and xylose by C. glutamicum. This study will firstly construct an efficient xylose-metabolizing C. glutamicum strain and establish a quantitative determination system of xylose translocation. Based on the deletion of PtsG, the MFS xylose transporter will be revealed through gene overexpression and knockout, and consequently the whole xylose translocation system of C. glutamicum will be elucidated. The exogenous MFS protein will be expressed and verified in C. glutamicum, if the endogenous protein cannot be found. Through molecular mutagenesis and high-throughput screening, the mutants of MFS protein which are released from glucose inhibition will be obtained, and the inhibition mechanism of xylose translocation by glucose will be uncovered via protein structure modelling. This study will be helpful for in-depth understanding of MFS xylose transporters, and lay a solid foundation for industrial practices such as aromatic amino acid fermentation and utilization of lignocellulosic materials.

谷氨酸棒杆菌中木糖主要通过葡萄糖PTS系统转运，因此，葡萄糖对木糖转运的抑制成为其同步利用葡萄糖和木糖的主要障碍。同时，谷氨酸棒杆菌存在一条尚未解析的木糖转运途径：主要异化子超家族（MFS）蛋白，对其深入研究有望成为解决这一问题的关键所在。本项目首先构建高效代谢木糖的谷氨酸棒杆菌，建立木糖转运定量检测体系。在失活葡萄糖PTS系统的基础上，通过分子遗传学手段解析MFS木糖转运蛋白，从而揭示谷氨酸棒杆菌完整的木糖转运系统。将得到的内源MFS木糖转运蛋白，或者合适的外源转运蛋白，进行分子突变和高通量显色筛选，获得解除葡萄糖抑制的突变。根据蛋白结构模拟研究葡萄糖对MFS蛋白转运木糖的抑制机理。在上述基础上，构建高效同步利用葡萄糖和木糖的谷氨酸棒杆菌。项目研究对于深入理解谷氨酸棒杆菌MFS蛋白木糖转运途径具有重要意义，同时为芳香族氨基酸等发酵过程添加木糖和综合利用木质纤维素资源的生产实践奠定基础。

谷氨酸棒杆菌为重要的氨基酸工业生产菌株，扩展其可利用的底物谱具有重要的社会经济学意义。利用废弃的木质纤维素资源替代粮食原料为当前形势所驱，而木质纤维素水解液中的戊糖（主要为木糖）成分不能被多数微生物利用。本研究通过对催化木糖进入中心代谢的两个关键酶木糖异构酶和木酮糖激酶的表达模式进行了优化，构建了谷氨酸棒杆菌高效木糖代谢途径。在该研究过程中，发现木酮糖激酶高表达会对细胞生长造成显著抑制作用，可能的机制是该酶磷酸化木糖代谢副产物木糖醇形成抑制物木糖醇-5-磷酸。通过寻求替代木酮糖激酶和降低胞内木糖醇浓度两种策略进行了探索，但没有实现预期结果。在谷氨酸棒杆菌高效木糖代谢的基础上，发现葡萄糖对木糖利用产生明显抑制作用，且主要发生在糖的摄取水平。因此，本项目系统研究了谷氨酸棒杆菌的糖转运途径。结果表明，在谷氨酸棒杆菌中，葡萄糖的摄取通过PtsG和IolT蛋白，而木糖也可以通过这两条途径被细胞吸收；另外还存在未知的木糖运输途径，推测为非特异性MFS蛋白。由于IolT为肌醇特异性运输蛋白，其对葡萄糖和木糖均为非特异摄取，因此对两种糖分子没有偏好性。而PTS系统为葡萄糖特异性途径，在葡萄糖存在的条件下，细胞对木糖的吸收受到明显抑制。通过对PTS系统各组分的敲除实验，发现木糖的运输仅依赖于膜结合的PtsG组分，而不依赖于参与级联磷酸化过程的PtsH和PtsI，因此发现了PTS系统对两种糖分子不同的转运机制。于是对PtsG上参与磷酸基团转移的氨基酸位点进行了突变，获得不能运输葡萄糖但对木糖运输能力没有改变的突变体。通过组合应用IolT、PtsG及其突变体，不但实现了木糖和葡萄糖的同步利用，同时获得了一系列具有不同葡萄糖和木糖代谢速率的菌株。后续代谢工程研究中，可以根据目标产物有针对性选择特定的菌株作为底盘细胞，通过其对葡萄糖和木糖的不同利用速率，实现产物合成的最大转化率。同时也可以根据不同来源木质纤维素水解液的糖浓度配比，选择合适的菌株进行废弃廉价原料的开发利用。