大肠杆菌混合碳源利用中木糖转运瓶颈的解除机制研究

Glucose and xylose are the most abundant sugars in lignocellulosic hydrolysates. The efficient co-utilization of the glucose-xylose mixture is therefore crucial for the bioconversion of lignocellulosic feedstock to chemical products. As an important chassis organism, Escherichia coli has apoor efficiency of glucose-xylose co-utilization due to the xylose uptake bottleneck. This project plans to solve this problem through a two-step engineering strategy. First, the expression level of the global regulator Mlc is tuned to relieve the transcriptional repression of xylose transport and metabolism exerted by the phosphotransferase system (PTS), then after compensating the loss in glucose transport caused by the PTS regulation by increasing the expression level of non-PTS glucose transporter and kinase, the xylose transport capacity is enhanced by heterologous expression of xylose transporter from Bacillus coagulans. The engineering of carbon catabolite repression and xylose transport is thereby systematically combined to illustrate the mechanism of eliminating the xylose uptake bottleneck. Meanwhile, to illustrate the effects of the bottleneck elimination on the fermentation efficiency from mixed carbon sources, biosynthesis of the platform chemical isoprene was used as an example to demonstrate the capacity of E. coli as an efficient cell factory to produce bulk chemicals from the glucose-xylose mixture in lignocellulosic biomass. The illustration of the elimination mechanism of the xylose uptake bottleneck will lay a solid theoretical basis for the efficient conversion and utilization of biomass, and vigorously promote the biomass industry for bulk chemicals production from lignocellulose.

葡萄糖和木糖是木质纤维素水解液的主要成分，葡萄糖-木糖混合碳源的有效共利用对高效转化生物质制备化工产品具有重要意义。然而，目前大多数微生物，包括工业上常用的大肠杆菌，对葡萄糖-木糖混合碳源的利用效率较低，其中一个重要原因是木糖转运造成的瓶颈。为了探讨木糖转运瓶颈的解除机制，本项目计划从两个方面进行研究：首先利用全局调控因子Mlc对磷酸转移酶系统进行转录水平调控，解除碳分解代谢物阻遏效应对木糖转运造成的抑制；然后对来源于凝结芽孢杆菌的木糖转运蛋白进行异源表达，增强大肠杆菌的木糖转运能力。同时，为了揭示木糖转运瓶颈的解除对于混合碳源发酵的影响，本项目将以异戊二烯作为模式产物，探究大肠杆菌工程菌株高效转化葡萄糖-木糖混合碳源生产大宗化工产品的能力，从而进一步理解造成木糖转运瓶颈的原因及解除机制。葡萄糖-木糖混合碳源利用中木糖转运瓶颈解除机制的阐释将为实现生物质的高效转化提供坚实的理论基础。

异戊二烯作为合成化学工业的基础原料，被广泛应用于合成橡胶、医药、香料和农药等领域，其巨大的市场和传统化学法的原料瓶颈导致其生物合成受到越来越广泛的关注。而木质纤维素广泛存在于自然界中，是一种丰富的可再生资源，可以为化学品的生物合成提供可持续性的原材料。本研究围绕生物质基异戊二烯的异源合成，开展了一系列探索性的研究。一方面在底盘细胞中构建和优化异戊二烯生物合成途径；另一方面针对木质纤维素原料的有效利用，进行木糖转运和糖代谢改造。. 首先以大肠杆菌为底盘生物，成功构建了异戊二烯生产菌株，并通过对MEP途径关键酶进行改造以及对上下游途径进行平衡调控，成功地使异戊二烯产量提高了4.7倍。期间考虑到木质纤维素原料在水解过程中除了释放葡萄糖、木糖等单糖，还会产生乙酸、糠醛等有害副产物，而大肠杆菌对这些物质的耐受性远不如酿酒酵母；并且大肠杆菌的异源途径表达往往需要添加IPTG等诱导剂，在成本方面对于异戊二烯等大宗化学品的生产不利，因此将底盘细胞换成酿酒酵母进行研究。为了构建能够利用木糖高效合成异戊二烯的酿酒酵母菌株，本研究一方面围绕异戊二烯合成途径和关键酶开展代谢调控和蛋白质改造，大幅提升异戊二烯产量，由mg/L水平提高到g/L水平；一方面通过表达外源木糖异构酶和对相关途径基因进行表达调控，并在此基础上探索对木糖转运蛋白进行分子改造的方法，提高菌株对木糖的利用效率，初步实现酿酒酵母利用木糖作为碳源合成异戊二烯的代谢途径。在研究过程中，还开发了适用于酿酒酵母的途径组装工具盒和多位点敲除系统，设计了新型的高通量筛选方法用于途径关键酶的分子改造，提出并验证了蛋白质改造和代谢调控相结合的综合调控策略。. 通过本项目的研究，显著提高了底盘生物大肠杆菌和酿酒酵母的异戊二烯合成能力，初步构建了能够利用木糖产异戊二烯的酿酒酵母菌株，为利用生物质原料生产异戊二烯奠定了初步的研究基础，并且为其他萜烯类天然产物的异源合成及其调控提供了借鉴。