香港海鸥型菌中喹诺酮类抗生素的耐药机制研究

Laribacter hongkongensis is an emerging pathogen associated with gastroenteritis and diarrhea, and quinolones are recommended for infected patients who need antimicrobial treatments. Quinolone resistant strains were recently identified among clinical and environmental L. hongkongensis isolates, but the molecular mechanism for resistance has not been reported yet. This study was design on the basis of our previous work to screen quinolone-resistant L. hongkongensis isolates and to characterize the resistance mechanism in these strains. Known quinolone resistance mechanisms in bacteria will be analyzed in L. hongkongensis. The quinolone targeting genes will be first sequenced in the resistant strains and the functions of point mutations will be determined. Then the intracellular drug concentration dynamics will be assayed and its relationship with the expression of active efflux pumps and porin proteins will be evaluated. Thirdly, the presence of plasmid-mediated quinolone resistant genes will be detected in the resistant strains by specific PCR, and the roles of these genes in resistance will be characterized. Furthermore, a genomic DNA library will be constructed to screen potentially novel resistance genes in quinolone resistant L. hongkongensis. This study will reveal the molecular mechanism of quinolone resistance in L. hongkongensis, and provide experimental evidences for antimicrobial therapy in Laribacter-related diseases.

香港海鸥型菌是一种与肠胃炎和腹泻相关的的新现病原菌，喹诺酮类抗生素是对该菌感染的病人进行抗菌治疗的推荐药物。最近，从临床和环境标本分离的香港海鸥型菌中发现了喹诺酮耐药菌株的存在，但其耐药的分子机制仍不清楚。本研究拟在前期工作的基础上，从临床和环境分离株中筛选得到喹诺酮耐药菌株，一方面对已知的喹诺酮耐药机制开展研究，首先对耐药菌株的药物作用靶位基因进行序列测定，并对突变位点进行功能分析；其次通过追踪耐药菌株中胞内喹诺酮药物浓度的变化，研究其与主动外排泵和膜蛋白通道表达水平的关系；再用特异性PCR法检测耐药菌株中质粒介导喹诺酮耐药基因的分布情况，确定这些耐药基因在喹诺酮耐药中的作用。另一方面建立耐药株的基因组DNA文库，筛选发现潜在的新型喹诺酮耐药基因。本研究将全面揭示香港海鸥型菌中喹诺酮耐药的分子机制，为该菌相关疾病的抗菌治疗提供实验依据。

项目背景：香港海鸥型菌是一种与肠胃炎和腹泻相关的的新现病原菌，喹诺酮类抗生素是对该菌感染的病人进行抗菌治疗的推荐药物。近年来，从临床和环境标本分离的香港海鸥型菌中发现了喹诺酮耐药菌株的存在，但其耐药的分子机制仍不清楚。..主要研究内容：本研究在前期工作的基础上，从临床和环境分离株中筛选得到喹诺酮耐药菌株，一方面对已知的喹诺酮耐药机制开展研究，首先对耐药菌株的药物作用靶位基因进行序列测定，并对突变位点进行功能分析；其次通过抑制剂法，研究主动外排泵的表达和耐药性的关系；再用特异性PCR法检测耐药菌株中质粒介导喹诺酮耐药基因的分布情况，确定这些耐药基因在喹诺酮耐药中的作用。另一方面用高通量测序的方法，对耐药菌株的全基因组进行测序，以阐明耐药株的耐药分子机制。..重要结果和关键数据：本研究对157株香港海鸥型菌进行了分析，发现其中21株为环丙沙星耐药菌株，并对这些菌株进行了喹诺酮耐药决定基因区域（QRDR）、获得性喹诺酮耐药（ADR）基因和外排泵与耐药关系的测定研究。结果发现，90%耐药菌株在gyrA和parC基因上发现存在喹诺酮耐药相关突变，包括gyrA T85I、T85R、D89N、D89G和parC S83R、R231C，这些突变可在不存在其他耐药相关因素的情况下，使耐药菌株的环丙沙星MIC上升30-240倍，证实了这些突变和喹诺酮耐药密切相关；对21株耐药菌株进行了质粒介导的喹诺酮耐药基因的检测，发现约40%的菌株携带aac(6')-Ib-cr基因，这是国际上首次在香港海鸥型菌中发现该耐药基因；用ERIC-PCR对21株耐药菌株进行了同源性分析，发现这些菌株具有不同的基因型，证实这些菌株为散发分布，不是由同一克隆株流行而来；在外排泵基因抑制剂CCCP存在的情况下，测定了21株耐药株的环丙沙星耐药性，发现CCCP不能影响环丙沙星的MIC，说明外排泵基因很可能没有参与耐药性的形成。..科学意义：本研究在国际上首次深入研究了新现病原菌香港海鸥型菌的新现喹诺酮耐药性的分子机制，尤其是发现可在多种细菌中传播的aac(6')-Ib-cr基因，提示了喹诺酮耐药性在该种细菌种进一步扩散的可能性，为临床治疗和卫生预防相关疾病提供了重要的实验数据。