喹诺酮类耐药脑膜炎奈瑟菌的耐药性溯源研究

Neisseria meningitidis can cause meningococcal meningitis, a severe infectious disease. Ciprofloxacin is recommended by WHO for meningococcal chemoprophylaxis, which is an important measure to control the spread of meningococcal diseases. With the quinolone-resistant N. meningitidis rare in other countries, they account for 72% in China and used to cause epidemics. In the previous study, we discovered two predominant quinolone-resistant clones named ChinaCC4821-R1-C/B (unique in China) and ChinaCC5-R14-A. They acquired the resistance by point mutation and horizontal gene transfer (HGT), respectively [PLoS Med 2015], but the origin of the resistance gene remains unclear. This study is supposed to isolate strains of different Neisseria species from healthy population, to sequence the gyrA gene for phylogenetic analysis, which can give clues to the origin of the DNA fragment mediating resistance. Then natural transformation can be used to import the DNA fragments of the gyrA quinolone-resistance determining region from the two resistant clones and the identified origin of ChinaCC5-R14-A into quinolone-susceptible N. meningitidis strains. The ability of N. meningitidis to acquire resistance by HGT can be verified by detecting the changes of quinolone-susceptibility of the strains. This study can systematically demonstrate the origin and means by which N. meningitidis acquires the resistance against the quinolones.

脑膜炎奈瑟菌（Nm）可引起严重的传染性疾病（流脑），预防性使用环丙沙星是WHO推荐的控制流脑传播的重要手段。喹诺酮类耐药Nm菌株在国际上少见，但在国内占比达72%，并曾引起暴发流行。在前期研究中我们发现了2个在中国占优势的耐药克隆ChinaCC4821-R1-C/B（中国特有）和ChinaCC5-R14-A，分别通过靶位点突变和耐药基因水平转移的方式获得耐药性（PLoS Med 2015），但耐药基因的来源尚不清楚。本项目拟从健康人群分离多种奈瑟菌的菌株，进行gyrA基因测序，构建进化树，分析介导耐药性的DNA片段的可能来源；利用自然转化技术，将2个耐药克隆和已确认为耐药性来源的其他奈瑟菌的gyrA基因QRDR区DNA片段转入Nm喹诺酮敏感株，分析菌株药物敏感性的变化，以验证Nm通过水平基因转移获得耐药性的能力，从而系统地阐述脑膜炎奈瑟菌对喹诺酮类药物耐药性的来源和获得方式。

脑膜炎奈瑟菌可引起严重的传染性疾病（流脑），预防性使用环丙沙星是WHO推荐的控制流脑传播的重要手段。喹诺酮类耐药脑膜炎奈瑟菌菌株在国际上少见，但在国内占比达72%，并曾引起暴发流行。在前期研究中我们发现了2个在中国占优势的耐药克隆ChinaCC4821-R1-C/B（中国特有）和ChinaCC5-R14-A，分别通过靶位点突变和耐药基因水平转移的方式获得耐药性，但耐药基因gyrA片段的来源尚不清楚。本项目于2005-2018年从病人和健康人分离出198株脑膜炎奈瑟菌，环丙沙星耐药率为67.7%（134/198），所有菌株都存在GyrA蛋白QRDR区的氨基酸突变，主要是两个位点：T91位（n=123）和D95位（n=12），另外有7株菌还存在ParC蛋白QRDR区的氨基酸突变，包括3个位点：D86位（n=2）、S87位（n=4）和E91位（n=1）。同时期从健康人群分离出293株共生奈瑟菌，检测其环丙沙星敏感性并进行gyrA基因测序，发现耐药率为97.7%且耐药株都携带了GyrA突变（T91I和D95N），另外有29株菌含有ParC蛋白的突变。使用本项目获得的gyrA序列和来自PubMLST奈瑟菌数据库收录菌株的gyrA序列构建进化树，发现我国喹诺酮耐药株中53.4%的菌株的gyrA片段来自共生奈瑟菌，包括乳糖奈瑟菌、灰色奈瑟菌和浅黄色奈瑟菌。其中ChinaCC5-R14-A 的gyrA片段来自灰色奈瑟菌，而ChinaCC4821-R1-C/B的gyrA片段来自自身点突变。寻找到8株菌的具体的供体株。通过自然转化技术，这8个供体株（7株乳糖奈瑟菌和1株灰色奈瑟菌）全部成功向喹诺酮敏感的脑膜炎奈瑟菌转移了包含有gyrA基因的DNA片段（608-8188 bp），所产生的重组菌株（转化株）全部呈现喹诺酮耐药的表型（环丙沙星MIC为0.125或0.19 ng/μl）。本项目的研究明确了耐药克隆ChinaCC5-R14-A耐药性的来源为灰色奈瑟菌，证实了超过半数的脑膜炎奈瑟菌通过水平基因转移的方式从三种共生奈瑟菌获得了喹诺酮类耐药性，而这种水平基因转移是在具有喹诺酮类药物筛选压力之下发生的，从而提供了科学数据说明喹诺酮类耐药性的产生和升高是喹诺酮类药物的大量使用所导致的结果。