小SpyCas9的合理设计和优化

CRISPR/Cas9 system derived from bacteria and archaea has been used as a genome editing tool for eukaryote successfully. However, applications of Cas9 in mammalian somatic tissue in vivo have remained challenging due to difficulties in delivery of the Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9), the most widely used Cas9 but with very large molecular weight exceeding the capacity of adeno-associated virus (AAV). Therefore, it’s eager to re-engineer and condense the SpyCa9. Here, we propose to design 450 sgRNAs, covering the full length of SpyCas9, to screen the variants of SpyCas9 in Hela cells harboring the gene of SpyCas9. Via combination of the mutant sites, we aim to generate smaller SpyCas9s with high efficiency and low off-target effect. This work will ensure co-delivery of Cas9 with one or more sgRNA in a single AAV vector and make a significant step towards the development of CRISPR/Cas-based therapeutics.

起源于细菌和古细菌的CRISPR/Cas9系统已广泛应用于真核细胞的基因编辑，但是在体应用于哺乳动物的体细胞中却非常困难，因为目前最为常用的、来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpyCas9）分子量过大，限制其被包装进入临床应用的腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV），因此在SpyCas9的基础上进行Cas9的重新设计和改造变小非常必要。本课题拟通过构建450条覆盖全长SpyCas9的sgRNA文库，在整合SpyCas9的细胞系中筛选Cas9突变体，通过组合突变点位置，优化出较小、高效、低脱靶效应的SpyCas9突变体。通过本课题，使SpyCas9和一个或者多个sgRNA同时装载到同一个AAV上成为可能，促进CRISPR/Cas9在临床上的应用。

起源于细菌和古细菌的CRISPR/Cas9系统已广泛应用于真核细胞的基因编辑，但是在体应用于哺乳动物的体细胞中却比较困难，因为目前最为常用的、来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpyCas9）分子量过大，限制其被包装进入临床应用的腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV），因此在SpyCas9的基础上进行Cas9的重新设计和改造变小非常必要。本项目通过构建450条覆盖全长SpyCas9的sgRNA文库，在整合SpyCas9的细胞系中筛选出37个Cas9突变体，通过优化Spy9突变体文库构建，我们从364个突变体中筛选到48个高活性的Cas9突变体，通过组合突变点和脱靶筛选，我们构建了较小、高效、低脱靶效应的SpyCas9突变体。.在研究过程中，我们发现内源性的APOBEC3会攻击单链DNA模板，诱导Cas9介导的单链DNA修复DSB过程中产生点突变。利用双链DNA模板，或敲降APOBEC3，可以有效降低点突变的发生。 这一研究结果提示，在利用CRISPR/Cas9基因组编辑工具开展同源重组修复的过程中，双链寡聚核苷酸作为修复模版比单链寡聚核苷酸具有更高的保真度；同时，在利用Cas9切刻酶开展基因组编辑的操作过程中，抑制细胞内源性APOBEC3的表达，可进一步提高基因组编辑的精确性。这一工作为提高基因组编辑技术的保真度提供了理论依据和新思路，也为临床应用打下了基础，相关工作发表在2018年Nature Structure Molecular Biology上。.提高CRISPR/Cas9系统的保真性并最大程度地减少脱靶效应的前提是要清楚地了解spCas9和DNA之间的相互作用。我们利用单分子光镊技术和生化实验，证明post-PAM interaction这一全新作用位点对Cas9/sgRNA与目标DNA的结合、切割、解离均有着关键的调节作用，为进一步提高CRISPR/Cas9系统的精确性和安全性提供了一个全新的视角，相关工作发表在2019年Science Advances上。