两个结构域与结构域之间的连接在细菌趋化性组氨酸激酶中的结构和功能的研究

Bacterial chemotaxis is a mechanism by which motile bacteria move to favorable living condition. Bacterial chemotaxis histidine kinase CheA converts the sensory information detected by transmembrane chemoreceptors to a tunable chemical signal in the cytosol. Recently we have found that two interdomain linkers in CheA’s kinase core play important roles in CheA’s function: The linker between CheA dimerization domain (P3) and its catalytic domain (P4) is related to CheA basal autophosphylation, while the linker between the catalytic domain and the regulatory domain (P5) plays a role in signal transmission from chemoreceptors to the catalytic domain. After studying the P3-P4 linker in detail, we now propose to use a series of biological, biochemical, and biophysical methods to study 1) a possible long-range effect on P4’s conformation by ligand binding, 2) the role of the P4-P5 interdomain linker, 3) the functional role of the P3 domain besides dimerization, 4) the kinetics of some mutants of our interest. The results will further reveal the mechanism of CheA regulation as well as the interdomain linker mediated functional dependence among domains of a multi-domain protein.

细菌趋化性是游动细菌选择适宜生长环境的机制。细菌趋化性组氨酸激酶CheA把膜蛋白化学受体探测到的环境中的感受信号转化为细菌细胞内的可控的化学信号。多年对CheA、CheW和化学受体所组成的复合物的结构研究已描绘了此复合体的大致构造，但我们仍不清楚CheA在此复合物中是如何被调节。近期我们发现CheA结构域之间的连接在功能上起了重要作用：二聚结构域(P3)与催化结构域(P4)之间的连接与CheA未被调节时的基础自磷酸化有紧密关系；催化结构域与调节结构域(P5)之间的连接在CheA被化学受体调节中起了信号传递的角色。承接我们近期对P3-P4连接的集中研究，我们拟运用生物物理、生物化学和生物学一系列方法来研究1）配体对P4构象的影响、2）P4-P5连接的角色、3）P3除二聚以外的功能机制和4）相关突变体的酶动力学，以期进一步揭示CheA调节机制以及结构域之间连接在多结构域蛋白中介导的功能性关联。

细菌趋化性是游动细菌选择适宜生长环境的机制。细菌趋化性组氨酸激酶CheA把膜蛋白化学受体探测到的环境中的感受信号转化为细菌细胞内的可控的化学信号。多年对CheA、CheW和化学受体所组成的复合物的结构研究已描绘了此复合体的大致构造，但我们仍不清楚CheA在复合物中是如何被调节。近期我们发现CheA结构域之间的连接在功能上起了重要作用：二聚结构域(P3)与催化结构域(P4)之间的连接与CheA未被调节时的基础自磷酸化有紧密关系；催化结构域与调节结构域(P5)之间的连接在CheA被化学受体调节中起了信号传递的角色。本项目以这两个连接为中心进行了以下实验：1）设计体内筛选方法来搜寻有不同激酶活性的CheA连接突变体；2）筛选出几个CheA P4-P5连接的突变体，其激酶活性的范围为野生型CheA激酶活性的30%到670%，丧失了被受体激活的能力，甚至是在缺少P5结构域的情况下，这些连接突变株足以对激酶活性造成改变。这表明此连接是一个活跃的功能模块，能够对P4结构域的催化活性施加调控作用。3）由于对P3除二聚以外的功能机制相关研究的失败，我们对与P3-P4连接相关的研究的策略做了调整：希望借鉴对P4-P5连接研究的成功，通过对P3-P4连接的突变筛选获得有不同激酶活性的P3-P4连接突变体，然后再通过对含有不同连接突变体的P3结构域进行结构研究，从而能够规避在执行原申请书中所遇到的问题。目前我们已成功获得2个高活性突变体。4）筛选方法的成功拓展了我们的研究思路：我们将P4-P5连接突变体和P3-P4连接突变体结合组成CheA双连接突变体，对于组合的连接双突变体激酶活性的初步测定表明这两个连接互相影响，需要配合共同作用于激酶催化结构域。此外，该项目对多结构域蛋白质的研究显示多结构域蛋白在功能方面的优势。由此课题的启发下，我们运用蛋白质工程技术成功改进了一个具有应用价值的能将脂肪酸转化为烯烃的酶的活性和底物范围。