海葵毒素Av3对昆虫和哺乳动物钠通道位点3选择作用机制

Receptor site 3 on voltage-gated sodium channels is targeted by a variety of structurally distinct polypeptide toxins from scorpions, spiders and sea anemones. Despite extensive studies of the effects of these toxins on sodium channels, the mechanisms by which toxins interact with the sodium channel remain poorly understood at the molecular level. Av3 is a site-3 neurotoxin from the sea anemone Anemonia viridis. Like other site-3 neurotoxins, Av3 inhibits channel inactivation. However, it has been shown to be active only on insect sodium channels, but not on mammalian counterparts. This unique feature makes Av3 a unique model to explore potentially novel interactions between site-3 toxins and insect sodium channels. The overarching goal of this proposal is to understand the molecular mechanism underlying Av3 selectivity for insect sodium channels. We will identify unique sequences in the insect sodium channel that interact with the Av3 toxin by systematically replacing the extracellular loop sequences (containing potential site-3 toxin-interacting residues) of the Av3-sensitive BgNav1 channel from Blattella germanica with corresponding loop sequences of the Av3-insensitive rat brain rNav1.2a channel and vice versa. The resultant chimera sodium channels will be examined for altered Av3 activity in Xenopus oocytes. Such an analysis will reveal the loop(s) that are critical for Av3 action on insect sodium channels. Next, we will identify specific amino acid residues in the relevant loop sequences that are critical for BgNav1 interaction with Av3. The bioactive surface of Av3 will be investigated by peptide synthesis and two-electrode voltage clamp. Accomplishment of the proposed work will uncover the selectivity mechanism of Av3 on insect sodium channels. Such knowledge would be highly valuable for future design of new selective anti-insect compounds.

电压门控钠通道是许多杀虫剂的作用靶点。钠通道上至少有7个作用位点。作用于位点3的海葵毒素Av3是一个对昆虫有特异性选择，而对哺乳动物无活性、含27个氨基酸的多肽。其独特的分子结构使得它与其他位点3毒素与昆虫钠通道的结合方式不同。本项目探讨Av3对昆虫和哺乳动物钠通道位点3的选择作用机制。首先分别以德国小蠊和大鼠脑钠通道（BgNav 和rNav1.2）为背景构建嵌合体，将位点3胞外环序列互换，寻找Av3作用于昆虫钠通道的关键胞外环；在此基础上，通过定点突变技术，分别以BgNav和rNav1.2为背景，研究关键胞外环中的氨基酸对Av3选择性的贡献，寻找Av3作用的关键氨基酸；通过多肽合成和电生理技术研究Av3分子的活性表面；同时研究Av3引起昆虫钠通道结构域D3电压感受器的变化方式。通过以上研究，提出Av3与昆虫钠通道作用的模型，明确Av3对昆虫选择性的机制，为新型杀虫剂的设计提供信息。

电压门控钠通道是许多杀虫剂的作用靶点。钠通道上至少有7个作用位点。作用于位点3的海葵毒素Av3是一个对昆虫有特异性选择，对哺乳动物无活性、的多肽。其独特的分子结构使得它与其他位点3毒素与昆虫钠通道的结合方式不同。本项目探讨Av3对昆虫和哺乳动物钠通道位点3的选择作用机制，明确Av3对昆虫选择性的机制，为新型杀虫剂的设计提供信息。首先，通过比对德国小蠊和大鼠脑钠通道（BgNav1和Nav1.2）的受体位点3 D4/S1-S2、D4/S3-S4和调节区域D1/S5-SS1和D1/SS2-S6的氨基酸序列结构，以BgNav1-1a为背景，构建受体位点3胞外环的嵌合体，测试Av3对这些嵌合体通道的活性，寻找位点3胞外环中对Av3昆虫选择性起关键作用的胞外环。结果表明：DI/SS2-S6是Av3对昆虫选择性的作用的关键胞外环；D4/S1-S2、D4/S3-S4和调节区域D1/S5-SS1不是Av3的主要结合区域。在此基础上，比较德国小蠊DI/SS2-S6与大鼠rNav1.2a上对应区域序列差异，并进行氨基酸互换突变。结果显示：H404是Av3发挥昆虫选择性作用的关键氨基酸。进一步将H404分别替换为丙氨酸和苯丙氨酸，结果表明：哺乳动物钠通道对Av3不敏感的原因是rNav1.2a上与H404所对应位置的氨基酸的芳香族侧链极大地限制了其与Av3的结合。本项目还从毒素角度寻找Av3的活性表面。通过多肽合成对Av3结构进行改造，将Av3分子上的氨基酸逐个变为空间结构小的丙氨酸，测试这些衍生物对昆虫钠通道的活性。结果表明：三个芳香族氨基酸Tyr7，Trp8和Tyr18参与了Av3分子活性表面的构成，影响了Av3对昆虫钠通道的选择性作用；Ser23和Pro25上的侧链制约了Av3的选择性作用。采用定点突变技术，将结构域D3上电压感受器的电荷翻转，研究在Av3作用过程中，D3电压感受器S1-S4上正负电荷氨基酸之间相互作用方式的变化。结果表明：Av3在与昆虫钠通道结合时由于变构效应，D3的S2-E2，与R4，R5的相互作用被破坏。探讨了果蝇钠通道持续电流INap的起源。研究表明： 在D4-S4移动的过程中，中性氨基酸I260和A1731突变引发INap产生与D4的结构摄动相关，这对钠通道的快速失活具有重要影响。本项目明确了Av3对昆虫选择性的机制，为新型杀虫剂的设计和钠通道研究提供信息。