负调控因子SmMYB39与正调控因子SmbHLH7协同调控丹参酚酸类成分生物合成的分子机制

MYB and bHLH transcription factors are important regulators of phenolic acids biosynthesis in Salvia miltiorrhiza. We found that SmMYB39 was a negative regulator of phenolic acids biosynthesis and contained a bHLH-binding domain.SmbHLH7 a positive regulator of phenolic acids biosynthesis and contained a MYB interaction region. We speculated that SmMYB39 probably interacted with SmbHLH7 and regulated the biosynthesis of phenolic acids. However, the molecular mechanism is still unclear. On the basis of our previous work, we will find that ①Identify the interaction and the binding domain of SmMYB39and SmbHLH7 by Yeast two hybrid, Co-IP and BiFC technology; ②Analyze transcriptional activation and identify target genes of SmMYB39-SmbHLH7 by ChIP and EMSA;③Investigate function of SmMYB39 and SmbHLH7 to reveal regulation mechanism of the complex on phenolic acids biosynthesis by gene overexpression and RNAi. Finally, we will demonstrated molecular mechansim of SmMYB39 and SmbHLH tanscription factor on phenilic ancids biosynthesis in Salvia miltiorrhiza, and lay the foundation for uncovering the quality formation mechanism and molecular breeding of Salvia miltiorrhiza.

MYB和bHLH类转录因子是丹参酚酸类成分生物合成的重要调控因子，本团队研究发现：SmMYB39是丹酚酸合成的负调控转录因子，含有bHLH结合结构域，SmbHLH7是丹酚酸合成的正调控转录因子，含有MYB结合结构域。推测SmMYB39可能与SmbHLH7互作，协同调控了丹酚酸的生物合成，但其分子机制尚不清楚。本项目将在前期基础上，主要开展：①通过酵母双杂交、免疫共沉淀和双分子荧光互补技术，体内外鉴定SmMYB39与SmbHLH7的相互作用，确定二者互作区域；②利用染色质免疫共沉淀和凝胶阻滞实验鉴定SmMYB39和SmbHLH7协同调控的靶基因，分析SmMYB39和SmbHLH7复合体的转录激活功能；③采用基因过表达和RNA干扰技术，研究SmMYB39和SmbHLH7基因功能，阐明SmMYB39与SmbHLH7协同调控丹酚酸生物合成的分子机制，为揭示丹参药材品质的形成机制和分子育种奠定基础。

转录因子SmMYB39和SmbHLH7是丹参酮和丹酚酸积累的两个重要调控基因，本研究主要通过基因过表达和RNAi的方法研究了SmMYB39和SmbHLH7对丹酚酸和丹参酮生物合成的调控作用，并阐明了SmMYB39和SmbHLH7的互作机制。.1. SmbHLH7基因在丹参植株六个不同组织（花、叶、茎、根皮、中柱、须根）均有表达，不同程度的响应了MeJA、ABA和GA的诱导，并定位于细胞核中。.2. 诱导了SmbHLH7过表达毛状根，HPLC检测发现SmbHLH7对酚酸类和丹参酮类物质的积累都是促进的作用。SmbHLH7同时显著提高了丹酚酸和丹参酮生物合成途径上的关键酶基因表达。利用酵母单杂交实验发现SmbHLH7可以结合到酚酸类物质代谢途径上C4H1、TAT、HPPR、CYP98A14和丹参酮类物质途径上DXS2、CPS1、CYP76AH1、KSL1的启动子区。.3. 利用酵母双杂交实验发现 SmbHLH7可以与SmMYB39互作，对SmbHLH7和SmMYB39蛋白序列分析发现其互作区域可能位于各自N端，将蛋白截短之后采用酵母双杂交实验验证了这一猜测。.4. 分别获得了SmMYB39过表达和RNAi干扰的转基因毛状根，发现SmMYB39不但负调控了酚酸类成分的积累，对丹参酮类成分的积累也是负调控作用。SmbHLH7的RNAi沉默毛状根中酚酸类和丹参酮类物质的含量相对于对照都显著减少。分析发现SmMYB39和SmbHLH7调控酚酸类和丹参酮类物质代谢的基因具有重叠。将SmbHLH7和SmMYB39共同过表达发现SmMYB39的表达量可以提高到对照的几百倍，而SmbHLH7的表达只提高了近10倍。在过表达SmbHLH7的同时将SmMYB39沉默后酚酸和丹参酮的积累也得到促进，而且促进作用要高于单独过表达SmbHLH7或单独沉默SmMYB39的毛状根。SmMYB39的过表达会抑制SmbHLH7的转录，沉默SmMYB39后SmbHLH7的表达得到提高；而过表达SmbHLH7会促进SmMYB39的转录，沉默SmbHLH7后SmMYB39的表达受到抑制。说明两个转录因子之间除在蛋白层面有相互调节之外，在转录层面也可以直接互相调控。