膜脂-蛋白质相互作用介导溶酶体膜通透的机制研究

Lysosomal membrane permeabilization is one of the key steps associated with apoptosis under physiological or pathological conditions. However, the precise mechanisms remain elusive. Related research progress will be beneficial for the understanding of apoptosis, and will be valuable for the design of drugs targeted to the lysosomal membrane. Our previous research revealed that lysosomal membrane is rich in phosphatidic acid. Upon proapoptotic stimuli, trace amount of tBid was formed by activated caspase 8, which interact with phosphatidic acid via lipid-protein interactions. The recruitment of tBid to lysosomal membrane induces the membrane permeabilization directly, and triggers the delocalization of lysosomal chymotrypsin, which is account for the induction and execution of apoptosis. Based on these preliminary data, the present investigation will focus on the following points: 1. The alteration of lysosomal lipid composition during apoptosis. 2. The mechanism underlying the interaction between tBid and lysosomal membrane. 3. The dynamics of conformation change of tBid during its association with membrane lipids. 4. The mechanism of the formation of lipidic pore in lysosomal membrane.

溶酶体膜通透是多种生理病理条件下细胞凋亡的关键步骤之一，但其机制尚不清楚。对此进行深入研究不仅有助于全面了解细胞凋亡过程，还可为以溶酶体为靶标的抗肿瘤药物设计提供基础理论。申请人在前期工作中发现溶酶体膜富含酸性磷脂--磷脂酸。在细胞凋亡的早期，活化的凋亡酶8剪切BCL-2家族成员Bid形成痕量tBid，tBid与溶酶体膜磷脂酸发生膜脂-蛋白质相互作用并被募集至溶酶体膜，继而发生寡聚化、引发溶酶体膜通透、介导释放胰凝乳蛋白酶释放至胞浆、启动细胞凋亡程序的执行。拟以此为切入点，整合脂质组学、单分子荧光共振能量转移等技术方法,从细胞、亚细胞及分子水平系统研究：①细胞凋亡过程中溶酶体膜脂质构成的动态变化；②溶酶体膜脂质与tBid等蛋白相互作用的分子机理；③tBid等在溶酶体膜发生构象转变的动态过程；④tBid等介导溶酶体膜形成脂质孔道的精确机制。通过以上研究，阐明溶酶体膜通透的精确机制。

溶酶体的动态变化与稳态维持常伴随着内膜系统的崩解、重构和融合，由特定的蛋白所介导，在生命活动中发挥着重要作用，并与多种疾病的发生发展密切相关。本项目以溶酶体膜的动态变化的调控机制为中心科学问题，第一部分内容以细胞凋亡的线粒体-溶酶体途径为基础，对BCL2家族的促凋亡蛋白Bid在溶酶体膜上形成通道、诱导膜通透并启动细胞凋亡的分子机制进行了研究。首先证实tBid可以在不借助其他蛋白的情况下与磷脂膜（模拟溶酶体膜组分）结合并诱导膜通透，形成允许较大分子透过的通道；为了进一步研究tBid诱导膜通透的分子机制，应用单分子表面诱导的荧光衰逝技术，向tBid蛋白特定氨基酸位点标记荧光分子并结合单颗粒追踪，实现了对tBid蛋白在磷脂膜上三维运动的动态分析；通过对大量单分子数据进行统计与分析，发现当tBid蛋白单体与磷脂膜结合时，其α6和α7螺旋嵌入膜的深度较浅；随着与磷脂膜作用时间的延长，部分tBid蛋白分子的α6和α7螺旋更深入地嵌入磷脂膜中，并在膜上形成不同聚集程度的稳定寡聚体，在寡聚体内部分蛋白分子嵌入膜更深的位置（α3螺旋嵌入膜的深度可至1.5 nm，α6和α7螺旋为2.0 nm）。据此提出tBid诱导膜通透的环形通道模型。此外，还对BAX或BCL2L1与tBid相互作用的二元体系进行了研究，并确认在BAX的作用下，tBid的α3和α6螺旋可嵌入到磷脂膜内更深的位置；而在BCL2L1存在时，原本嵌入膜内的螺旋则伸展在膜表面甚至游离在膜外，其原因可能是tBid的BH3结构域与BAX或BCL2L1发生相互作用，导致tBid在膜上的构象发生改变。.第二部分重点研究了磷酸化修饰调控转录因子TFEB转位入核的结构生物学机制。确定TFEB的S211是影响与YWHA发生相互作用的关键磷酸化位点，并定量确定了TFEB pS (211)磷酸肽与YWHA两个亚型的亲和力参数。通过X射线衍射的方法解析了TFEB pS (211)磷酸肽与YWHA的复合物晶体的三维结构，确定TFEB pS (211)磷酸肽通过疏水作用力、静电作用和氢键与YWHA紧密结合。.部分实验结果发表于Autophagy等重要学术期刊（5篇）；参加中国生物物理大会、中国化学会年会并作报告；培养博士生4名，硕士生2名；1名课题组成员晋升副研究员。