基于RA成纤维样滑膜细胞自噬异常探讨三水白虎汤抑制滑膜增生的机制研究

The abnormal proliferation of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA-FLS) take a key role in the pathogenesis of RA. It has been shown that abnormal autophagy of FLS is an important mechanism of synovial hyperplasia and maybecome a key target of RA therapy. Our previous studies have shown that Sanshuibaihu decoction (SSBH) has a significant inhibitory effect on synovial hyperplasia and bone erosion of RA, but the mechanism has not been fully elucidated. In the precious studies, we found some of active ingredients of SSBH can regulate cell autophagy, and resveratrol can inhibit the synovial hyperplasia of RA by inhibit FLS autophagy. Therefore, we speculated that SSBH inhibits the synovial hyperplasia of RA may be related to its regulation of FLS autophagy. This topic intends to determine the mechanisms that SSBH inhibited synovial hyperplasia of RA by regulate FLS autophagy in vitro and in vivo. We will detect the difference of the proliferation of FLS, the expression of FLS autophagy-related protein and mRNA, the apoptosis proteins and inflammatory cytokines among SSBH group, autophagy inhibition control group and the normal group by use of some experimental techniques such as immunohistochemistry, flow cytometry, laser confocal microscopy and RT-PCR. It will supplement the mechanisms of SSBH inhibite synovial hyperplasia of RA and provide scientific basis for the application of this decoction.

类风湿关节炎（Rheumatoid athritis,RA）成纤维样滑膜细胞(FLS)的异常增殖在RA发病中处于中心位置。研究表明，FLS自噬异常是滑膜增生的重要机制，可能是RA治疗的一个关键靶点。前期研究表明，三水白虎汤(SSBH)具有显著的抑制RA滑膜增生及骨侵蚀的作用，但其机制尚未完全阐明。我们在对SSBH有效成分鉴定等研究中发现多种有效成分能调控细胞自噬，白藜芦醇还能抑制FLS自噬而抑制关节炎。因此，我们推测SSBH抑制RA滑膜增生的机制可能与其调控FLS自噬异常有关。本课题拟通过体外、体内实验，利用免疫组化、流式细胞术、激光共聚焦、RT-PCR等实验技术评估SSBH干预组与自噬抑制对照组中FLS的增殖情况，FLS自噬相关蛋白、mRNA的表达差异以及相关的凋亡蛋白、炎症因子差异，确定SSBH调控FLS自噬环节抑制滑膜增生的效果和机制，为该方治疗RA提供科学依据。

本项目体外实验通过利用细胞转染技术敲低类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(Rheumatoid Arthritis Fibroblast-like Synoviocytes , RA-FLS) 内的BECN编码蛋白1（Beclin-1）基因,观察三水白虎汤（Sanshuibaihu decoction,SSBH)对人类RA-FLS自噬行为的影响，测定SSBH对细胞生长的表达情况；然后采用WB和RT-PCR检测滑膜细胞自噬相关蛋白和RNA的表达水平。体内实验通过利用人肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）转基因关节炎（Tgtc）小鼠模型，观察SSBH连续灌胃30天后的关节变形指数、ELISA检测血清哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target Of Rapamycin,mTOR）、Atg1蛋白激酶复合体(Unc-51-like kinase 1,ULK-1)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达水平；同时获取干预后的Tgtc小鼠踝关节组织，透射电镜观察滑膜组织上自噬体情况，HE染色观察滑膜炎症细胞浸润、滑膜增生、软骨和骨侵蚀等组织病理情况，并进行滑膜组织微管相关蛋白1A/1b-轻链3B（LC3B）、mTOR、ULK-1、Bcl-2等免疫组化、免疫荧光检测，评定自噬基因的表达。本实验明确了SSBH通过调控自噬信号通路抑制人类RA滑膜增生的作用和机制，具有以下重要意义：（1）透射电镜发现SSBH能减少Tgtc小鼠关节滑膜组织中的自噬体，从形态学上确证SSBH下调自噬水平抑制滑膜增生，为后续机制研究的可行性提供保障。（2）从滑膜细胞自噬角度阐明SSBH抑制人类RA滑膜增生的分子机制，完善了SSBH治疗人类RA的作用机制,为SSBH治疗RA提供科学依据，具有较高的推广应用价值。（3）探讨了SSBH调控 RA-FLS 自噬过程中对体内免疫炎症的调节作用及与 FLS 凋亡失衡的关系，揭示了SSBH促进FLS凋亡和抑制免疫炎症的作用机制。（4）mTOR与RA-FLs的自噬密切相关，以mTOR信号通路和自噬关键基因LC3、Beclin-1、ULK-1作为研究靶点，探索SSBH抑制自噬的机制与mTOR信号通道的联系，拓展SSBH抑制FLS自噬的调控环节，为临床上SSBH治疗RA开拓新的思路。