鲤鱼背肌中肌球蛋白非结合型组织蛋白酶L的modori作用研究

本项目以淡水鲤鱼为原料，利用水产化学、食品化学、蛋白质和酶学以及现代生化分离手段，以项目负责人已有对18种常用鱼糜原料鱼特别是鲤鱼中所含蛋白水解酶的组织分布和相关生化特性的研究积累为基础，研究鲤鱼背肌中所含肌球蛋白非结合型组织蛋白酶L对modori现象的参与作用及其作用机理，解明目标酶的modori作用机制，从理论角度阐明和完善长期以来备受关注却尚未明了的modori机理。另外从鱼糜制备废弃液中回收分离内源性抑制剂，同时筛选高效安全的食用级抑制剂，从实际生产角度为解决严重制约淡水鱼糜制品行业发展的技术难题提供有效的解决方案。本项目适应国内水产资源现状，为淡水鱼深加工提供有效途径，有助于弥补国内水产品加工与保鲜基础理论研究的不足，为今后充分利用淡水鱼蛋白质资源提供理论依据和实际生产技术指导。

鲤鱼背肌虽经多次漂洗、稀释沉淀处理，肌动球蛋白中依然残留组织蛋白酶L活性，漂洗水中检测到内源性抑制剂的存在。青、草、鳙鱼及南蓝鳕鱼糜结果与鲤鱼情况类似。根据凝胶层析图谱分析，鲤鱼组织蛋白酶L具有两个活性主峰，一个与肌动球蛋白一致，另一个明显偏离。将肌动球蛋白解离成肌动蛋白和肌球蛋白后的凝胶层析结果表明，组织蛋白酶L为肌球蛋白非结合型。将两个活性主峰的层析组分收集，通过胰蛋白酶、组织蛋白酶等专一性抑制剂的抑制效果实验，验证了两者均属含硫半胱氨酸蛋白酶家族。两个活性主峰在50-60℃的温度范围内均具有降解肌球蛋白重链的作用，从而导致鱼糜凝胶强度的降低。将鲤鱼原料冰藏4天，或将肌动球蛋白冻藏8周，内含组织蛋白酶L的活性有所降低，但降低幅度不大，表明组织蛋白酶L性质较为稳定。通过热处理、硫酸铵沉淀后透析并浓缩、离子凝胶层析除去杂蛋白等一系列的处理，获得电泳水平的纯化组织蛋白酶L。底物专一性检测表明其为组织蛋白酶L，其最适作用温度为50℃、最适pH为5.5；热稳定性强，活性被E-64、leupeptin等抑制、被DTT及EDTA等激活，而PMSF、STI等丝氨酸蛋白酶激活剂的对组织蛋白酶L影响不明显。以上性质与南蓝鳕等海水鱼糜中含有的组织蛋白酶L酶学性质基本类似。在鲤鱼、大眼鲷等鱼糜中添加纯化的组织蛋白酶，结果发现，追加组织蛋白酶L使得鱼糜凝胶强度降低30以上。通过SDS-PAGE及电镜扫描图谱分析，可知组织蛋白酶L降解肌球蛋白重链，使得形成的鱼糜凝胶结构松散，空洞较大。由此可知组织蛋白酶L为鱼糜凝胶劣化现象的参与酶，其作用机理主要是通过水解肌球蛋白重链，鱼糜凝胶形成受阻，导致凝胶劣化。鉴于实验中使用的E-64、亮肽酶等抑制剂虽可有效抑制凝胶劣化现象，但两者均为化学试剂，不能直接用于实际鱼糜生产。本研究筛选聚谷氨酸及可得然复配谷氨酰胺转氨酶作为低品质鱼糜凝胶增强剂。从色泽、持水性、凝胶强度等多角度，结合加热工艺，通过响应面优化试验，发现γ-聚谷氨酸添加量0.54 ‰、第一段加热温度52.6 ℃、加热39 min时，可使鱼糜凝胶强度提高20%以上；可得然添加量5.2%、TG添加量0.45%、第一段加热温度37℃、加热120min时，可使鱼糜凝胶强度提高50%以上。电镜扫描图谱显示两者均可使形成的鱼糜凝胶致密均匀，提高鱼糜凝胶强度。发表论文9篇；申报专利3项（2项已授权）。