非肌性肌球蛋白IIA突变引起MYH9相关疾病的分子机制研究

Mutations in MYH9 gene encoding the heavy chian of nonmuscle myosin IIA (NM IIA) results in a human syndrome named MYH-related diseases (MYH-RD). The mechanisms by which single point mutation in MYH9 leads to the MYH9-RD presently remain unclear. We postulate that the two distinct but not unrelated functions of NM IIA: translocating actin filaments and cross-linking actin filaments, are affected by MYH9 mutations leading to the alteration of the actomyosin stress fiber structure and functions, which consequently impairs the normal functions of the cells. To test this hypothesis, three disease causing mutations (R702C、D1424N and E1841K) are selected for the study based on their high frequency of mutations and phenotypic severity observed in patients. Full-length proteins of the mutant NM IIAs will be produced using our previously established methods. Biochemical analyses and electron microscopy (EM) will be used to investigate the effects of the mutations on these aspects of NM IIA, such as ATPase activity and in vitro motility, filament assembly, actin binding behavior. Cell lines which express both mCherry (mCh)-tagged wild type and GFP-tagged mutant NM IIA will be generated using a gene knock-in protocol. The dynamics and morphology of stress fibers, as well as subcellular localization of the wild type and mutant NM IIA will be analyzed using confocal microscopy. Finally, functions of NM IIA in cell migration and adhesion will be studied in mutant cells. Results from this study will reveal the molecular mechanisms of MYH9-RD and provide scientific basis for the therapy of the disease.

编码非肌性肌球蛋白IIA(NM IIA)重链的MYH9基因突变导致MYH9相关疾病(MYH9-RD)，但其分子机制仍不清楚。我们推测MYH9突变影响NM IIA两个不同但密切相关的功能：驱动actin运动和参与actin交联，导致由它组成的应力纤维结构和功能改变，进而引起细胞功能异常。为证实该假说，拟以高发且致病的R702C、D1424N和E1841K突变为研究对象；通过真核表达系统获得全长NM IIA突变体蛋白，利用生化方法和电镜技术分析突变体的酶学活性、运动性能、分子组装、与actin结合行为；构建不同荧光蛋白标记野生型和突变型NM IIA的基因敲入细胞模型，利用激光共聚焦显微镜研究此两种NM IIA组成的应力纤维动力学、形态及胞内定位；最后功能上分析突变细胞在NM IIA主要参与的细胞迁移与黏附过程中可能的异常。研究结果有助于揭示MYH9-RD的分子机理，并为该疾病治疗提供科学依据。

非肌性肌球蛋白II（NM II）在生物体内具有提供动力、影响病毒感染甚至癌症发生等重要功能，其缺失导致严重后果如发育异常、胚胎死亡。编码NM IIA重链的MYH9基因突变导致MYH9相关疾病（MYH9-RD），而其分子机制仍不清楚。针对上述问题，我们开展了如下研究：A）研究了三个重要的导致MYH9-RD的点突变（R702C、D1424N和E1841K）对于全长NM IIA分子体内、外结构与功能的影响；B）探讨了MYH9基因位点作为新的定点敲入外源基因安全位点的可行性；C）分析了MYH9基因位点高效同源重组效率的潜在生物学特征。通过上述研究，取得的主要结果如下：.1）通过表达纯化突变体全长蛋白质分子，分离/构建表达不同荧光蛋白标记的野生型和突变体NM IIA稳定细胞系，探明了MYH9基因点突变对NM IIA分子酶活性、分子组装特性、细胞内定位、应力纤维动力学等的影响，这些研究结果支持了我们提出的假说，并为部分解释MYH9-RD疾病机制提供了科学依据。.2）发现了在MYH9基因外显子2位点进行基因打靶其同源重组效率极高（>90%）这一罕见并具有重要价值的现象，从其临近位点定点敲入效率、外源基因表达模式、内源MYH9基因表达及功能完整性等方面证实MYH9基因外显子2及邻近位点可作为定点敲入外源基因的一个新的安全位点。.3）揭示了MYH9基因位点所显示出的超高同源重组效率可能与同源臂中存在的特定元件如简单重复序列、短散布核元件等有关，证实了基因打靶效率与同源臂总长呈正相关以及最佳的5’与3’同源臂长度比例为2:1。另就应用Southern blot与PCR技术鉴定ES细胞中同源重组事件的方法进行文字与影视介绍。. 上述研究结果与发现的意义体现在进一步明确了MYH9基因突变如何影响NM II分子结构与功能，发现了新的基因敲入安全位点，阐释了打靶效率与同源臂长度、元件、比例等关系，将可为研究其它myosin功能与疾病提供科学借鉴，还可为基因打靶/编辑技术应用提供技术指导。