基于填精补肾理论在新型X-连锁低磷性佝偻病(XLH)实验模型中探讨疾病干预与作用机制

X-linked hypophosphatemic rickets (XLH) is one of the rare inherited diseases. We found a de novo mutation in a XLH pedigree: Genetic analysis found that (c.433G>T, p.Glu145*) in Exon 4 of PHEX (NM_000444.5) is consistent with the genetic characteristics of family, and it might be a potentially pathogenic mutation. In pre-experiment, the mutant cells were successfully cloned and functionally identified as defective mutations. This project will carry out gene function research and build a mouse model of knocking in point mutation with CRISPR/Cas9 technology. Studying from the phosphatonins, bone metabolism-related protein pathways to investigate the clinical phenotype, functional variation and pathogenesis of this mutation. And try to use proteomics method to rummage the possible target protein’s upstream regulatory proteins and pathways. In addition, XLH belongs to the "five kinds of retardations and flaccidity" category in Traditional Chinese Medicine, which is caused by congenital renal deficiency, so the treatment is the application of replenishing essence and invigorating kidney. This project will observe the classical Zuogui pill intervention of XLH model in treating the rickets, such as the regulation of various phosphatonins, and the variation of related protein. It is a exploration on the efficacy and regulation mechanism of Zuogui Pill in the treatment of XLH model, by which a theoretical support in guiding the optimization of integrated traditional Chinese and Western medicine in the scheme formulation for the treatment of XLH will be provided furtherly.

X-连锁低磷性佝偻病(XLH)属于遗传性罕见病之一。我们在一XLH家系中发现一个新发突变点：PHEX(NM_000444.5)基因Exon4中的(c.433G>T, p.Glu145*)，家系分析发现其符合家系遗传特征，高度可疑责任突变位点。在预实验中，成功克隆构建此突变型细胞，功能鉴定为缺陷突变。本课题将进行突变功能研究，且应用CRISPR/Cas9技术点突变敲入小鼠造模，从调磷因子、骨代谢相关蛋白通路研究此突变的临床表型、功能变异与发病机制。并试图用蛋白组学寻找目的蛋白的可能上游调控蛋白与通道。另外，XLH属于“五迟五软”中医范畴，系先天肾精不足引起，治疗予填精补肾，本课题将观察治疗佝偻病的经典补肾填精方“左归丸”干预XLH模型，如调控各种磷调节因子及相关蛋白变化。予中西医结合方法探索左归丸治疗XLH模型的疗效与调节机制，进而为指导优化中西医结合治疗XLH方案提供理论支持。

X-连锁低磷性佝偻病(XLH)属于遗传性罕见病之一，致病基因是PHEX的功能缺失突变。目前的研究大多基于该模型对磷调节因子 FGF23、Na/Pi-2a、DMP-1、Klotho 等基因单敲除或双敲除，研究各蛋白之间的上下游调控关系[4-7]。然而缺乏PHEX蛋白表达就无法根据蛋白稳态的机制对 XLH 进行干预研究，所以探索构建既能表达蛋白又能模拟疾病表型的细胞和动物模型对后续通道蛋白功能鉴定和药物干预研究至关重要。基于此，我们拟在前期临床发现典型 XLH 患者的突变基因 PHEX（p.E145*及Trp749Arg）的基础上，采用CRISPR/Cas9 技术点突变敲入小鼠造模，构建表达突变型 PHEX 蛋白的疾病动物模型。我们成功构建新发现PHEX基因上突变型及野生型PHEX基因以及secPHEX 、FGF23、FGF23启动子过表达载体，在分子、细胞层面证实了PHEX 基因上突变型 p.(Glu145*及Trp749Arg)的细胞的功能缺陷。并进一步采用双荧光素酶报告基因验证了PHEX基因突变后对FGF23启动子具有上调作用。成功构建杂合突变、纯合突变小鼠模型和野生型小鼠模型。采用同位素标记相对和绝对定量进行knock-in小鼠成骨和肾组织蛋白质组学差异分析，得到差异蛋白的分子功能主要参与蛋白结合过程。KEGG分析得出差异蛋白主要与代谢通路、氧化磷酸化通路有关。含左归丸药物血清对胚肾HEK293T细胞系和成骨细胞的影响中，观察到PHEX-mut含药血清组表达量高于PHEX-mut组，FGF23表达低于PHEX-mut组，PHEX酶活性高于PHEX-mut组。且差异具有统计学意义。动物模型成功后，予左归丸干预，观察到左归丸干预组小鼠的相关指标无显著差异。该研究证实了PHEX基因是X-连锁低磷性佝偻病(XLH)高度可疑责任突变位点，并且PHEX通过调控FGF23启动子来调控FGF23水平从而调节学磷酸水平。为后续研究佝偻病治疗的分子机制提供理论支持。成功构建PHEX145mut佝偻病模型小鼠，并且质谱分析得出差异蛋白主要与代谢通路、氧化磷酸化通路有关，虽然目前左归丸干预突变型小鼠无显著性差异，可能原因为观察周期不够长，或者左归丸治疗量不够等原因，可以为以后的研究提供一些研究基础，更好的改进之后的研究方案。