从细胞间缝隙通道探讨补肾填精法对化疗损伤性卵巢早衰的保护性实验研究

The increased survival rate of cancer patients with chemotherapy drugs due to an increased emphasis on iatrogenic damage. At the same time, it has become an important cause of premature ovarian failure. Study found that gap junction play an important role in the follicular growth and development process. The method of reinforcing kidney supplying emission is an effective method of traditional Chinese medicine in preventing and treating the POF. Preliminary study showed that Zuogui pill has significant protective effects on aging mice ovary. This project will make POF model in rats induced by cyclophosphamide. To observe the effect of Zuogui pill on sex hormone FSH and E2 of serum in rats, to observe the effect of Zuogui pill on microstructure and ultrastructure of ovarian tissue in rat, to observe t he expression and distribution of Cx37 and Cx43 protein in ovarian tissue, to observe the expression of Cx37mRNA and Cx43mRNA gene in the rat ovary, in order to explore the method of reinforcing kidney supplying emission on the protective effect and mechanism of ovary. To observe the effect of Zuogui Pill on rat pregnancy outcome and the growth and development of offspring fetal rat, to observe the effect of stress reaction on rat ovary , in vitro maturation of oocytes and in vitro fertilization, So as to demonstrate the hypothesis of the method of reinforcing kidney supplying emission protect the reproductive function.

化疗在使患有各种肿瘤和免疫性疾病患者存活率和治愈率得到提高的同时，却成为卵巢早衰发病的一个重要原因。研究发现细胞间缝隙通道在卵泡生长发育过程中发挥着重要作用。补肾填精法是中医药防治卵巢早衰的有效方法。前期研究发现补肾填精代表方剂左归丸对增龄小鼠卵巢具有明显的保护作用。本项目拟在化疗药物环磷酰胺致大鼠卵巢早衰模型上，观察左归丸对大鼠血清性激素FSH和E2的影响、观察左归丸对大鼠卵巢组织显微及超微结构的病理学影响、观察左归丸对大鼠卵巢Cx37和Cx43蛋白分布及表达量的影响、观察左归丸对大鼠卵巢Cx37mRNA和43mRNA基因表达的影响，以探寻补肾填精法对卵巢的保护及机制；观察左归丸对大鼠妊娠结局和子代胎鼠生长发育的影响、观察左归丸对大鼠卵巢的应激性反应以及对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响，以论证补肾填精法保护生育功能的假说。

化疗在使患有各种肿瘤和免疫性疾病患者存活率和治愈率得到提高的同时，却成为卵巢早衰发病的一个重要原因。研究发现细胞间缝隙通道在卵泡生长发育过程中发挥着重要作用。补肾填精法是中医药防治卵巢早衰的有效方法。前期研究发现补肾填精代表方剂左归丸对增龄小鼠卵巢具有明显的保护作用。本项目制作化疗药物环磷酰胺（CTX）致小鼠卵巢早衰模型，用补肾填精的代表方剂左归丸进行干预，发现左归丸可有效改善化疗致POF模型小鼠动情周期紊乱；有效升高POF模型小鼠血清E2含量，降低FSH含量；提高POF模型小鼠子宫、卵巢系数；改善POF模型小鼠卵巢组织病理学改变；下调POF模型小鼠卵巢颗粒细胞凋亡，恢复卵巢功能。左归丸可有效改善化疗致POF模型小鼠卵巢功能低下状态，其机制与调节血液性激素水平，改善内分泌功能，调节动情周期，增加生殖器官重量，抑制卵巢颗粒细胞凋亡有关，从而延缓卵巢衰老进程，恢复卵巢功能。左归丸上调化疗致POF模型小鼠卵巢Cx37mRNA和Cx43mRNA基因表达，上调卵巢组织Cx37和Cx43蛋白表达及在在卵巢颗粒细胞中的表达，推测左归丸通过调节卵巢内缝隙连接功能来改善卵巢功能。通过左归丸对CTX致POF模型小鼠妊娠结局及子代胎鼠影响实验，发现左归丸可有效改善POF孕鼠生长状况，改善子代胎鼠生长发育情况，具有一定保护作用。在卵母细胞体外成熟及体外受精实验中，CTX减少停留在第一次减数分裂前期的卵母细胞（GV）数量、阻碍卵母细胞生发泡破裂（GVBD）、降低卵母细胞体外成熟（即PB1排出）能力、减少小鼠排出MII卵母细胞的数量、显著降低卵母细胞受精能力并阻止受精卵发育，而左归丸上调GV量、促进GVBD以及PB1排出，左归丸高剂量组提高受精能力，并对受精卵的发育阻滞有一定的纠正作用。而且发现CTX影响小鼠MII卵母细胞内纺锤体的形成，推测由CTX诱导的异常纺锤体形成可能是随后受精率下降的原因之一，左归丸中、高剂量组可适当纠正由CTX导致的纺锤体形成异常，从而提高受精率。本研究为化疗损伤性卵巢早衰导致的卵巢功能低下和生育障碍这一棘手问题的解决提供可靠的理论及实验依据。