基于磷酸化蛋白质组学在雷公藤甲素保护足细胞损伤机制的研究

Chronic kidney disease is the global burden of major noncommunicable diseases, and podocytes injury has close relationship with it. Podocytes-intervention is an important treatment to remedy chronic kidney disease. Protein phosphorylation is an important post-translational modification. Enzymes involved in the process have become an important target for drug research and development. Currently, We have already used traditional Chinese medicine Tripterygium to treat the kidney disease and achieved significant clinical effect. We have confirmed Triptolide is one of the main active substances with good antiproteinuric and podocytes protective effect, the mechanism may be related to the inhibition of p38 phosphorylation. Triptolide treats puromycin aminonucleoside podocyte-injury-mode, protein collects and labels by iTRAQ and digestion, IMAC for the selective enrichment of phosphorylated peptides, the enrichment sample detect with mass spectrometric and relative quantitative analysis with bioinformatics software and find out possible target of triptolide. We will verify these results in vitro, in vivo and clinical sample. The study will provides more in-depth information of kidney disease pathogenesis and understand the mechanism of triptolide.

慢性肾病是威胁人类健康的一类重大疾病，而肾小球足细胞的损伤与其具有密切关系。因此，针对足细胞损伤后干预是治疗多种慢性肾病的重要药理学基础。蛋白磷酸化作为一种重要的蛋白翻译后修饰，参与该过程的酶类已经成为药物开发的重要靶标。目前，我所已经使用中药雷公藤治疗肾脏病取得重大临床效应，并且研究证实了雷公藤甲素是其主要的活性物质，具有良好的抗蛋白尿以及足细胞保护作用，机制可能与抑制p38的磷酸化相关，但需要进一步深入研究。本项目在此前雷公藤甲素研究的基础上，通过氨基核苷嘌呤霉素造足细胞损伤，使用雷公藤甲素干预，将细胞蛋白收集裂解后通过iTRAQ法标记消化，IMAC法对样品进行磷酸化富集，将富集后样品进行质谱检测并做相对定量分析以及后期生物信息学处理，推测出可能的雷公藤甲素作用靶标。并且在后期研究中，使用体内外模型以及临床样本进行验证。本研究将深化雷公藤甲素治疗慢性肾病药理机制的认识。

本项目以雷公藤甲素为研究对象，以磷酸化蛋白质组学为主要技术手段，研究雷公藤甲素是否通过调控蛋白的磷酸化发挥其药理学功效。本研究发现，氨基核苷嘌呤霉素通过调控自噬相关信号通路、细胞周期相关信号通路、凋亡相关信号通路诱导组细胞凋亡。而雷公藤甲素可能调控自噬以及细胞周期信号通路发挥其足细胞保护作用。鉴于氨基核苷嘌呤霉素国内禁止出售，后续验证研究采用顺铂或者阿霉素造模，观察雷公藤甲素的肾脏保护作用，但活性不明显。因此，又选择了其他化合物，发现花青素以及四羟基异黄烷酮对顺铂或者阿霉素造成的肾损伤具有保护作用。此外，由于肾毒性是多种抗肿瘤化合物的副作用之一，而雷公藤多甙片肾脏保护作用明确，并且同雷公藤甲素一样，去甲泽拉木醛做为雷公藤多甙片成分之一，有报道其具有肾脏保护作用。因此，推测去甲泽拉木醛是否对顺铂或者阿霉素具有减毒增效的药理活性。因此以荷瘤鼠动物模型，协同给予去甲泽拉木醛与顺铂或者阿霉素，通过观察瘤块大小以及HE染色后肾脏固有细胞的形态发现去甲泽拉木醛确实具有减毒增效作用。此后，又通过组织western blotting检测EMT相关蛋白表达，发现其抑制了肿瘤组EMT相关蛋白表达以及肿瘤细胞的转移。最后，我们又在实验中发现一个新型生物碱evodiagenine具有光细胞毒活性。综上所述，通过该研究，我们初步发现了氨基核苷嘌呤霉素导致足细胞损伤的机制，而雷公藤甲素可能是通过调控自噬、细胞周期相关蛋白的磷酸化，进而发挥足细胞保护作用的。此外，发现雷公藤多甙片中另一个活性化合物去甲泽拉木醛具有协同顺铂的抗肿瘤活性，并减轻了不良反应。最后，又在研究中发现了一个新的具有光敏毒性的天然产物evodiagenine。因此，通过该研究，不仅初步完成了原计划书的工作，而且也在原计划的基础上取得了一些新的研究进展，发现了一些新的药理现象，为中药现代化提供了新的科学依据。