转运蛋白TwPDR1在介导雷公藤甲素胞外分泌中的功能与磷酸化调控机制

Tripolide is a labdane diterpenoid epoxide that possesses various kinds of pharmacological activities, however, many restraining factors made it in short supply and fancy price. The hairy root cultures of Tripterygium wilfordii Hook.f., established by the participant of applicant previously, contrain much higher contents of triptolide than the wild roots, while, with only 14 mg/L. Because the efflux and transfer of secondary metabolites is one of the key strategies for production enhancement, it’s of great research significance to regulate the transcription level and activity of transporters through genetic engineering. To this end, a potential efflux transporter of triptolide, TwPDR1, was cloned by the applicant previously. In this project, the function of TwPDR1 will be firstly verified by substrate transporting assay and RNAi, etc.; then, the regulation mechanism of TwPDR1 by phosphorylation will be illuminated using techniques, such as site-directed mutagenesis and western blot; finally, to achieve the goal of improved secretion ratio and total production of triptolide, transgenetic hairy roots of Tripterygium wilfordii Hook.f. will be induced and cultured, expressing TwPDR1 or its phosphorylation mimic variant. The researches on efflux transportation and its regulation are of great significance to plant metabolic engineering and prospective microbial heterogenous synthesis for triptolide.

雷公藤甲素是一种具有多种药理活性的环氧化二萜，但多种制约因素导致其供应不足、价格昂贵。申请人前期参与构建的雷公藤发状根培养体系具有较野生根更高的产率，然而含量也仅有约14 mg/L。由于次生代谢物的胞外分泌及其转移是提升产量的关键策略之一，因而，利用基因工程技术调控转运蛋白的转录水平以及活性具有重要的研究意义。为此，申请人前期克隆得到一个潜在的介导雷公藤甲素胞外分泌的转运蛋白，TwPDR1。本项目拟在前期研究基础上，首先通过底物转运活性测试、RNAi等证实TwPDR1的转运功能；接着，利用定点突变和蛋白质印迹等技术阐明TwPDR1的磷酸化调控机制；最后通过诱导和培养过表达TwPDR1基因及其模拟磷酸化变体的雷公藤发状根，达到稳定提高雷公藤甲素分泌率及总产量的目的。胞外转运及其调控研究对雷公藤甲素的植物代谢工程以及后续的微生物异源合成均具有重要的参考意义。

植物PDR类转运蛋白在次生代谢物转运中发挥着重要作用。次生代谢物的胞外分泌既有利于利用微生物异源合成时产量的提升，也有助宿主植物获得生物抗性。然而大量此类转运蛋白的功能尚未得以鉴定，且其活性调控机制也鲜有报道。本研究首先对一种具有潜在转运雷公藤甲素的转运蛋白，TwPDR1进行了功能鉴定。利用基因过表达、RNAi以及底物转运测试等技术发现其具有介导雷公藤甲素胞外分泌的功能。同时，利用定点突变等技术对磷酸化位点功能进行了解析，结果证实磷酸化修饰有利于该转运蛋白的转运活性。上述研究结果对雷公藤甲素的植物代谢工程以及后续的微生物异源合成均具有重要的参考意义。为进一步解析PDR类转运蛋白的磷酸化修饰机理，本项目还针对拟南芥PDR6转运蛋白的磷酸化调控机制进行了解析。研究发现两种AGC激酶家族成员，OXI1和AGC2-2可以直接磷酸化修饰PDR6并增强后者的活性以及稳定性。这一结果对于PDR类转运蛋白的磷酸化调控机理做了进一步解释，有利于后续对该类转运蛋白活性调控的全局认识。此外，由于PDR类转运蛋白的启动子上具有TGA结合元件，本研究还对雷公藤中TGA类转录因子，TwTGA1的功能进行了研究。结果证实TwTGA1在雷公藤次生代谢物生物合成中发挥着积极的调控作用。上述所有研究结果对于解析植物次生代谢物，尤其是雷公藤甲素，的转运以及生物合成机制具有重要的参考意义。基于该基金的经费支持，项目团队发表高质量学术论文2篇（另有一篇已投稿至bioRxiv预印本），申请国家发明专利2项。