Vps4通过调节exosomal microRNA表达谱参与肝癌细胞EMT调控的机制研究

The exosome secretory pathway plays an important role in HCC development and progression. Our previous studies have found that Vps4, a key regulator of exosome secretion, was down-regulated in HCC tissues. Our further studies demonstrated that overexpression of Vps4 inhibited proliferation, invasion and metastasis of HCC cells; and caused changes in the miRNA expression profiles in HCC-derived exosomes and the parental cells by small RNA sequencing. Meanwhile, Vps4 overexpression increased E-cadherin expression. The above results imply that Vps4 may be involved in EMT as a tumor suppressor by regulating miRNA expression profile of HCC cells via the exosome secretory pathway. To elucidate the mechanism, we intend to undertake the following researchs. First, we investigate whether the miRNA expression profiles in HCC-derived exosomes and the parental cells are modified by Vps4 overexpression, and explore the signaling pathways involved in EMT. Second, exosomes derived from Vps4-overexpressing HCC cells are co-cultured with untreated HCC cells to observe its effects on invasion and metastasis of recipient cells. This project aims to reveal the molecular mechanisms of Vps4 as regulator involved in EMT of HCC cells by regulating exosomal miRNA expression profiles, and provides new strategies for the treatment of HCC.

Exosomes分泌途径在肝癌的发生发展过程中起着重要作用。我们的前期研究发现其关键性调节因子Vps4在人肝癌组织中低表达。进一步的研究发现，上调Vps4能明显抑制肝癌细胞的增殖和侵袭转移能力；同时小RNA测序结果显示细胞和exosomes中miRNA表达谱发生改变；并且上调Vps4后，肝癌细胞E-cadherin蛋白表达增强。提示Vps4可能作为抑癌基因通过exosomes分泌途径调节肝癌细胞miRNA表达谱参与EMT调控过程。为深入阐明其机制，本课题拟开展以下研究：①上调Vps4，观察肝癌细胞和exosomes中miRNA表达谱的变化，并分析参与调控EMT过程的信号通路；②将处理后肝癌细胞分泌的exosomes与未处理细胞共培养，观察对其侵袭转移能力的影响。本课题旨在揭示Vps4通过调节exosomal miRNA表达谱参与EMT调控改变肝癌细胞侵袭转移能力，为肝癌的治疗开拓新思路。

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，肿瘤的复发转移是导致肝癌预后不良的主要原因。目前，肝癌的发生、发展、转移等机制尚未完全阐明。上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）被认为在大部分肿瘤（包括肝癌）的转移中扮演着重要角色。此过程可由多种信号通路介导，但在来源不同的肿瘤和不同的肿瘤微环境中，具体的介导机制有所不同。本课题组的前期研究结果发现，Vps4A可以通过调节Exosome及其来源细胞的miRNAs而发挥抑癌作用。然而，Vps4A是否影响肝癌的EMT过程及其具体作用机制并不清楚。我们为解决这一系列问题进行了相关研究。主要结果如下：1.过表达Vps4A抑制肝癌细胞的侵袭、浸润和EMT过程。在构建了SMMC7721和MHCC97H过表达Vps4A的细胞稳定株后，我们通过细胞划痕、transwell小室、western blot、qPCR及免疫荧光等方法检测了细胞侵袭和迁移、EMT相关标志物的变化。结果表明，过表达Vps4A后，细胞的浸润和迁移受到明显抑制，同时上皮细胞标志物水平升高，而间质细胞标志物水平明显下降。另外，通过免疫组化及查询分析公共数据库TCGA的数据等发现，Vps4A的表达量和EMT表型具有相关性。2.β-catenin 通路介导了Vps4A对肝癌细胞的EMT的抑制作用。Western blot、核蛋白检测及qPCR等结果表明，过表达Vps4A后，β-catenin核内蛋白量及其活性均降低。而过表达β-catenin可以补救由于过表达Vps4A引起的对EMT的抑制作用。.3. Vps4A通过β-catenin通路抑制肝癌细胞的EMT过程可（部分）由exosome介导。western blot、qPCR及免疫荧光结果显示将过表达Vps4A细胞来源的exosome加入对照组细胞后48小时，β-catenin的蛋白水平开始下降，72小时后，EMT相关标志物水平开始变化。同时，对照组细胞的浸润和迁移能力也受到一定程度的抑制。综上可知，Vps4A可通过β-catenin通路抑制肝癌细胞的EMT过程，而这一过程至少部分是由exosome所介导。这为我们进一步研究Vps4A的作用机制及其对肝癌细胞EMT过程的调节奠定了良好基础。