肝癌细胞调控exosomal microRNAs选择性分泌与摄取的作用机制

Exosomal miRNAs are important signaling molecules in human hepatoma cells. Changes in the expression profile of exosomal miRNAs will lead to alternations in cell fate. We found in previous studies that the secretion of exosomal miRNAs was a selective process. In co-culture experiments, the uptake of exosomal miRNAs was also a selective course. Vps4A, a regulator of exosomes, participated in regulating the secretion and uptake of exosomal miRNAs to exert a tumor-suppressive effect and caused the inactivation of the PI3K/Akt signaling pathway. Over-expression of Vps4A facilitated the accumulation of RNA binding protein GW182 in hepatoma cells. These results suggest that the hepatocellular carcinoma cells may selectively secrete and uptake exosomal miRNAs to maintain their tumor characteristics. To elucidate the mechanism, we plan to carry out following researches. First, through clinical samples and in vivo and in vitro experimental models, we aim to sort a batch of molecules which can significantly affect the secretion and uptake of exosomal miRNAs. Next, by immunoprecipitation and RNA immunoprecipitation experiments, we will further investigate the comodulation mechanism of exosome regulators and RNA binding proteins in the selective secretion and uptake of exosomal miRNAs. We are looking forward to providing fundamental basis for targeting exosomal miRNAs to interfere the occurrence and development of hepatocellular carcinoma.

肝癌细胞exosomal miRNAs是重要的信号分子，其表达谱的变化将导致细胞命运的改变。我们在前期研究中发现，肝癌细胞exosomal miRNAs分泌具有选择性，共培养实验发现其摄取也具有选择性； exosomes调控分子Vps4A参与调控其分泌与摄取以发挥抑癌作用，并可导致下游PI3K-Akt通路失活；过表达Vps4A可引起RNA结合蛋白GW182在肝癌细胞内积聚。提示肝癌细胞可能通过选择性分泌和摄取exosomal miRNAs以维持其“癌”性。为深入阐明此作用机制，本项目拟开展如下研究：①通过临床样本和体内外实验模型，筛选显著影响exosomal miRNAs选择性分泌/摄取的分子；②进一步通过IP和RIP实验，探讨exosomes调控分子和RNA结合蛋白共同调控其选择性分泌/摄取的机制。为探讨通过调控exosomal miRNAs来“干扰”肝癌的发生发展奠定理论基础。

肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，血管网络极其丰富并且血管异常增多，是一种高度血管化的实体瘤。上皮间质转化是指上皮细胞暂时转化为间质细胞状态的一个可逆过程，该转化可以赋予细胞较强的迁移和侵袭能力，促进肿瘤的转移和恶性进展。我们前期在研究肝癌来源外泌体内容物时除了发现exosomal miRNAs存在差异表达谱外，在蛋白质谱的研究上也有重大发现。本研究结合细胞、动物模型和临床样本，分析了ANGPT2在肝癌患者血清外泌体和肝癌细胞外泌体中的表达情况，研究了其通过外泌体途径分泌与被摄取的机制，探讨了其对肝癌细胞和HUVECs的生物学行为的影响，并且揭示了exosomal ANGPT2在肝癌细胞与HUVECs之间存在的循环再利用的调控网络。主要结果如下：1.研究发现肝癌患者血清中exosomes及肝癌细胞所分泌的exosomes富含ANGPT2；2.肝癌细胞exosomal ANGPT2被HUVECs细胞以内吞外泌体的方式摄取，并促进HUVECs的血管形成能力；3.肝癌细胞exosomal ANGPT2进入HUVECs胞内后与Rab5/Rab11均有相互作用，随后能通过exosomes途径被再次分泌至胞外，提示存在循环再利用的调控网络；4. 肝癌细胞exosomal ANGPT2激活AKT/eNOS和AKT/β-catenin通路。以上结果不仅发现肝癌源性外泌体携带ANGPT2，可通过内吞外泌体的方式被HUVECs所摄取，在肝癌细胞与HUVECs之间还存在循环再利用的调控网络，并且肝癌exosomal ANGPT2以一种不依赖Tie2信号通路的新途径促进肿瘤血管新生。此外，ANGPT2还可以促进肝癌的上皮间质转化活性。通过CRISPR/Cas技术敲低ANGPT2，不仅阻断肝癌外泌体源性ANGPT2导致的肿瘤血管新生，还能抑制肝癌的上皮间质转化活性，为研制新型的肝癌靶向治疗方法奠定基础。