DHPR蛋白K93T点突变在OLETF大鼠DN进展中的作用及分子机制研究

我国已成为全球糖尿病患者最多的国家，糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy,DN）是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一。DN发病机制复杂，目前尚不明确。课题申请人前期在对2型自发性OLETF DN大鼠模型肾皮质进行差异蛋白质组学研究时，发现二氢生物碟呤还原酶蛋白93位发生了K到T的点突变，而该突变位点在多种生物中十分保守。另有报道在多个DN模型及人类中均存在生物蝶呤代谢紊乱。提示该基因突变与OLETF大鼠DN的发生、发展密切相关。本研究拟利用慢病毒携带突变及正常DHPR基因，分别感染正常对照LETO大鼠及OLETF DN大鼠模型，观察该基因突变对DN进展的影响。并对比转染正常和突变基因对DHPR基因相关代谢途径及肾皮质蛋白表达谱的影响。通过探讨该突变在DN大鼠模型发生、发展中的作用及机制，将为全面深入理解该代谢途径在DN发病中的作用和发现潜在DN治疗药物靶点。

在本项目的资助下开展了QDPR基因在DN发病中作用及机制系列研究。⑴我们对人群QDPR基因多态性进行研究发现SNP位点rs3733570在DN中分布高于正常人，提示QDPR基因与人群DN相关。⑵我们发现QDPR基因主要表达于肝、脑、肾、胰腺等部位与糖尿病易受累部位相近。在肾脏QDPR高表达于肾小管上皮细胞，因此我们选取肾小管上皮细胞系NRK-52E作为研究对象。⑶我们制作了正常、K93T 突变QDPR基因过表达及QDPR基因敲低肾小管上皮细胞系作为后续研究的模型。我们发现K93T突变能使QDPR还原qBH2能力降低，信息生物学分析K93T可能是影响到了酶的空间构象，继而影响到了酶活性。另外我们发现高糖也能降低QDPR的酶活性。⑷在NRK-52E细胞模型上，我们考察了K93T 突变以及QDPR基因活性改变在正常及高糖环境下细胞周期、氧化应激以及TGF-β1、CTGF 、VEGF 、α-SMA、Ⅰ型胶原、SOD1、Vimentin 、TICAM 、MCP1、SLC5的mRNA和（或）蛋白含量的影响，发现QDPR基因活性改变可以影响到正常及高糖环境下众多DN。另外我们还考察了OLETF大鼠DN相关分子的改变。发现有些信号分子的变化与已知的变化方式不同，提示QDPR基因K93T突变以及QDPR活性改变可能对DN的发病有重要的影响。⑸在NRK-52E细胞模型上，我们考察了K93T 突变以及QDPR基因活性改变对PAH、TH、TPH1、TPH2、NOS1、NOS2、NOS3、PCBD、HNF1、DHFR的影响。发现QDPR基因活性改变可以影响到正常及高糖环境下众多相关代谢途径蛋白含量。另外我们考察了OLETF大鼠肾皮质QDPR相关代谢途径蛋白，有些也发生了改变，提示QDPR基因可能通过其相关代谢途径影响DN的进展。⑹在NRK-52E细胞模型上，我们考察了一些潜在与DN相关的分子发现K93T 突变以及QDPR基因活性改变对α-actinin、AHSG、GRP75、Decorin含量产生影响，尤其是AHSG在高糖环境下、QDPR高表达时含量增加数十倍。⑺我们开展了对K93T 突变、QDPR基因表达变化、高糖环境对NRK-52E细胞蛋白谱影响的比较蛋白质组学研究，发现10个DN相关蛋白。这些研究工作提示QDPR基因能通过影响其代谢相关基因影响DN的发生、发展，为DN防治提供了新思路。