基于肠道菌群研究参术调脾颗粒对OLETF大鼠的预防作用及机制

The imbalance of intestinal microbiota can activate the immune system, induce the inflammatory response, and lead to the dysfunction of Glucagon Like Peptide-1(GLP-1) that released from intestinal L-cells. Finally, accelerate the occurrence of type 2 diabetic mellitus(T2DM) from impaired glucose tolerance(IGT). The ShenzhuTiaopigranule (SZTP) intervention showed reduction in blood glucose levels and incidence of T2DM. The traditional Chinese medicine symptoms of patients in the SZTP intervention group were also markedly alleviated. Based on concepts of traditional Chinese medicine treatment IGT from the spleen, which may be result from intestinal microbiota regulation of traditional Chinese medicine. Sequencing analysis of the intestinal microbiota metagenomic 16S rDNA was applied to evaluate the role of SZTP treatment the IGT rat model. In vitro, we use Enzyme Linked Immunosorbent Assay todetect the GLP-1 levels that released from intestinal L-cells. Immune histochemicalwas used to calculate the number of intestinal L-cells. At the same time, MTT assay was performed to detect the intestinal L cell GLUTag cell viability. The apoptotic cells were detected by flow cytometry using Annexin V and propidium iodide . Radioimmunoassay was detected to the GLP-1 levels under treatment with containing medicine serum. we observe the proportion of IGT reverse to general population, and analyze the correlation relationship. In order to provide theoretical support and experimental basis for preventing T2DM by traditional Chinese medicine,

肠道菌群失调可激活免疫系统、启动炎症反应，并导致肠道L细胞合成分泌的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）功能异常，是糖耐量减低（IGT）向2型糖尿病（T2DM）转变的重要原因。具有循证医学证据的研究发现参术调脾颗粒可以改善IGT患者症状，降低血糖，减少T2DM的发生率。基于从脾论治IGT的中医理念，这可能与中医药调节肠道菌群有关。本研究采用肠道菌群宏基因组16S rDNA高变区测序技术研究参术调脾颗粒对IGT期OLETF大鼠肠道菌群的调节作用，酶联免疫吸附法检测体外肠道L细胞分泌GLP-1的变化，免疫组化法计数肠道L细胞数量。同时采用MTT法、流式细胞仪、放射免疫法检测含药血清对肠道L细胞株GLUTag细胞增殖、凋亡、GLP-1含量的影响。观察IGT期逆转为正常水平的比例，并进行相关性分析。通过体内外实验研究，为阐明中医药通过调节肠道菌群来预防T2DM发生提供理论支持和实验依据。

许多研究表明，肠道菌群可调节葡萄糖的稳态。多年来，中药复方已用于治疗多种疾病，例如糖尿病。多项研究表明，中药复方可有效降低T2DM中的血糖和糖化血红蛋白A1c（HbA1c）水平。在我们先前的研究中，参术调脾颗粒可以改善T2DM患者胰岛素抵抗并降低HbA1c。然而，尚不清楚肠道菌群的改变是否参与参术调脾颗粒引起的血糖改善。本项目研究目的是观察中药复方参术调脾颗粒对糖尿病大鼠的防治作用及探讨是否与通过调节肠道菌群有关。研究方法为使GK大鼠和与年龄匹配的Wistar大鼠适应性喂养1周。 GK大鼠随机分为4组。模型组（M组），阿卡波糖组（A组），益生菌组（E组），和参术调脾颗粒组（G组）。Wistar大鼠普通进食、进水（对照组，C组）。观察时间为8周。研究过程中测量大鼠体重。干预后6%水合氯醛腹腔注射，麻醉大鼠，打开腹部，取腹主动脉血，离心后 -80℃超低温冰箱存放，测空腹血糖（FBG）水平、血脂和GLP-1水平。截取大鼠结直肠约2 cm，挤出粪便，-80℃超低温冰箱存放，并对V3-V4区域的16S rRNA基因进行测序，分析了肠道菌群的结构。与C组相比，M组在血糖、GLP-1、肠道菌群等方面表现出显着差异（P <0.05；P <0.01）。Lactobacillus和Desulfovibrionaceae与T2DM发病显著相关。与M组相比，A组和G组的FBG降低和在肠道菌群结构中的shif降低相似（P <0.05；P <0.01），GLP-1水平增加。与A组相比，G组的体重、FBG水平和总胆固醇显着降低（P <0.05）。有关肠道菌群，G组显著降低了肠道中的Bacteroidetes、Firmicutes/Bacteroidetes ratio、Allobaculum、Desulfovibrionaceae，而Lactobacillus显着富集（P <0.05；P <0.01）。参术调脾颗粒增加了Proteobacteria、Deltaproteobacteria、Desulfovibrionales、Desulfovibrionaceae的数量而降低血糖。参术调脾颗粒能促使胰岛β细胞增多、细胞核增大、变圆，HE染色较淡染，胰岛内毛细血管增生较明显。参术调脾颗粒能进一步使结肠粘膜各层结构较清楚。本研究为从脾论治改善糖代谢及调节肠道微生物群提供了实验依据。