血流感染病原微生物非培养快速诊断方法的研究

快速检测、鉴定和药敏谱分析对于成功救治血流感染患者至关重要。传统培养鉴定方法虽为金标准，但存在检测结果滞后、生长缓慢菌和苛养菌敏感性差、受抗生素使用影响大等缺点，临床迫切需要研发快速、敏感、不受抗生素影响的快速诊断方法。本研究拟采用革兰染色特异探针荧光实时定量PCR技术直接从血液或无菌部位体腔液中扩增病原微生物的基因，并进行病原体载量检测，将扩增产物进一步与分别点样针对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌特异性探针的基因芯片进行核酸杂交，检测杂交信号判读鉴定病原微生物，从而达到快速诊断血流感染病原体的目的。同时，将本技术应用于临床标本，与传统血培养方法同步检测，综合分析其敏感性、特异性与检测周期，评价该方法在临床的应用前景。本研究不仅为血流感染病原学的快速诊断奠定了理论基础，而且为自主研发快速诊断试剂盒提供了技术平台，同时对血流感染的诊治具有重要意义，对临床微生物检验的发展具有巨大的推动作用。

快速检测、鉴定和药敏谱分析对于成功救治血流感染患者至关重要。传统培养鉴定方法虽为金标准，但存在检测结果滞后、生长缓慢菌和苛养菌敏感性差、受抗生素使用影响大等缺点，临床迫切需要研发快速、敏感、不受抗生素影响的快速诊断方法。本研究采用荧光实时定量PCR技术直接从血液或无菌部位体腔液中扩增血流感染临床常见分离病原微生物的基因，并进行病原体载量检测，将扩增产物进一步利用焦磷酸测序技术进行测序，鉴定病原微生物，从而达到快速诊断血流感染病原体的目的。同时，将本技术应用于临床标本，与传统血培养方法同步检测，综合分析其敏感性、特异性与检测周期，评价该方法在临床的应用前景。本研究首先通过查阅文献与国家法规，并对西安交通大学第一附属医院血培养标本进行分析，综合上述数据确定本研究建立的快速鉴定方法目标微生物的种类。通过对这些病原微生物的基因利用Clustal X软件进行多重序列比对，确定细菌检测靶基因为16S rRNA，而真菌为ITS1区域。采用SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增技术进行靶基因的扩增，进行微生物载量的确定。继而对扩增产物进一步利用焦磷酸测序技术进行测序，确定病原微生物的种类。通过对标准菌株与临床菌株的鉴定，其具有较高的敏感性与特异性。并通过建立模拟菌血症标本模型，对本研究的快速诊断方法进行评价，具有较高的检出率与准确度。同时对本研究的快速诊断方法与传统方法进行比对，能够明显缩短鉴定时间。本研究不仅为血流感染病原学的快速诊断奠定了理论基础，而且为自主研发快速诊断试剂盒提供了技术平台，同时对血流感染的诊治具有重要意义，对临床微生物检验的发展具有巨大的推动作用。