阵列微流控技术在血感染病原微生物快速培养、分离和鉴定中的应用

Rapid diagnosis of sepsis is still an unresolved problem of the modern era. In this proposal, we will carry out research work in four aspects including accelerating blood culture, realizing fast enrichment of pathogens in whole human blood, providing high sensitivity and high specificity on-chip detection, and rapid drug resistance screening. First, we will introduce an array culture method with small unit volume to increase the initial pathogen concentration and accelerate the growth, we will introduce a simple way to selectively filtrate blood cells and allow early growth of pathogens to be detected by imaging; second, we will develop and validate a broad-range separation approach to efficiently separate and enrich pathogen cells by dielectrophoresis; third, on-chip detection of captured pathogens will be realized by multiplex PCR and MALDI-TOF mass spectrometry; finally, we will introduce a chip-based antimicrobial susceptibility test for rapid determination of the causative pathogens. We envision that the methods developed in this research can provide a practical solution for early sepsis diagnosis, and it can be adopted for other applications such as food safety testing, water quality analysis and assessment of microbial communities in environment.

败血症的快速诊断是一个世界性的难题。本课题将从加快培养速度、实现血液致病菌的直接高效富集、实现高灵敏高特异性检测和耐药性筛查四个方面进行系统深入的研究。1）通过保证血培养样品的总体积在毫升级，将样品等分分配到微升体积的培养单元中，以加快培养速度，并通过选择性过滤和趋化作用实现血细胞和微生物的分隔和对早期生长的监测；2）通过微生物和血细胞在介电极化特性的差异，实现广谱高效的微生物介电电泳选择性捕获，为血液微生物直接检测和培养后检测提供有效的低浓度细菌分离富集方法；3）利用微流控芯片实现富集病原体阵列基因扩增检测和芯片原位基质辅助解析质谱指纹图谱鉴定；4）建立阵列式耐药性测试方法，快速测定微生物的耐药类型和耐药浓度。基于以上功能单元的开发与集成，有望实现低成本、高灵敏的快速血液感染广谱鉴定，缩短败血症诊断周期。以上方法也可应用于其他感染疾病诊断、食品安全检测和环境微生物群落分析等。

抗菌药物耐药是一个严重的公共卫生问题。开发准确、经济、高效的快速细菌耐药筛查方法，是减少药物滥用和控制耐药的关键。传统的耐药检测依赖于大型的进口仪器设备和医疗中心机构，费时费力，带来了造成了诊疗延误。本项目开展四方面研究：（1）统计了2008至2016年CHINET中国细菌耐药监测网的耐药菌株以及耐药基因，筛选出耐药率最高的菌株以及80个广泛流行的耐药基因；（2）建立了一种操作简单、适用性强、富集效率高的微流控广谱致病菌介电电泳捕获分析芯片，适用于直接捕获并富集血液、牛奶等生理样品中细菌，去除血细胞和血浆本底干扰，生理样品中的病原菌能够被介电电泳电极高效捕获；（3）针对临床血液样品和血培养阳性样品的直接检测，完成了微流控芯片细菌鉴定和药敏检测系统的搭建。包括集成阵列介电电泳和PCR筛查功能的血流微生物鉴定芯片，以及集成阵列介电电泳和药敏MIC测定功能的血流微生物耐药检测芯片，实现了临床样品中多种病原细菌的同时阵列化介电电泳捕获分离、阵列PCR扩增基因鉴定和耐药基因筛查、以及阵列药敏表型检测；（4）研制出全自动纳升液滴阵列耐药菌PCR检测和药敏分析系统可同时进行384个基因或药物的筛查。.取得结果如下：（1）在病原菌基因检测方面，针对临床常见的病原细菌设计了180对特异性的PCR引物，并对临床分离的60株致病菌进行了PCR验证，与临床质谱鉴定结果一致性达到89.6%。在病原菌耐药基因检测方面，针对常见的30种耐药基因，设计的60对特异性PCR引物全部进行了引物有效性的验证；（2）开发的广谱介电电泳微流控芯片对牛奶中病原菌的捕获效率提高到90%，对血液中病原菌的捕获效率从无法捕获到捕获80.2%；（3）开发的微滴阵列筛查系统可实现384种病原菌或耐药基因的PCR鉴定，PCR筛查时间<3小时；可以将药敏筛查的体积从常规的200 μL缩小到200 nL，对大部分菌株实现测试时间<5小时的药敏筛查。药敏性测试结果与传统方法一致性>90%。通过本研究建立的集成化、自动化、高通量微流控系统，为快速、低成本、现场血流感染检测和耐药筛查提供了新的思路。