内侧颞叶癫痫的线粒体功能障碍研究及其易感/突变基因分析

Based on the MTLE patients and rat models, by detecting the mitochondrial morphology and numbers, ATP production rate, the activity of respiratory chain enzyme complexes, calcium homeostasis, membrane potential, brain energy metabolism, the mitochondrial function in hippocampus will be explored globally. Then, by using cell model of epilepsy, neurons’ epileptiform discharge and interactive relationships will be detected after inhibition of single element of mitochondrial function. This research aims to discuss the role of mitochondrial dysfunction in the developing of MTLE and the interactions among the mitochondrial functions. Furthermore, by using generation sequencing technology, we will explore the genetic susceptibility genes in the MTLE patients and the mitochondrial gene mutations in MTLE rat models before and after epileptogenesis, and in the different stages of MTLE. Then, we try to identify new susceptibility/pathogenic genes of MTLE. From the gene level, protein level to function level in vivo, the research will firstly explore the role of mitochondrial dysfunction in the pathogenesis of MTLE comprehensively and the complicated relationships among either mitochondrial function. And we raised a new idea that susceptibility genes and mitochondrial gene mutations involving in the epileptogenesis of MTLE. The study will open new perspectives for the study of clinical refractory MTLE, providing a theoretical basis in order to avoid triggering factors of gene mutation and to identify optimum new biomarkers for pharmacological therapies of MTLE.

本项目针对MTLE患者和动物模型，从线粒体形态和数目、ATP生成率、呼吸链酶复合物活性、钙稳态、膜电位变化及在体患者大脑代谢情况等多个方面测定海马内线粒体功能变化；利用癫痫细胞模型，逐一抑制线粒体各功能后查看神经元放电情况以及各功能间有无相互影响，探讨线粒体各功能在MTLE发生发展中的作用及其相互作用关系。进一步地，利用二代测序技术，检测MTLE患者中有无线粒体相关遗传易感基因，以及MTLE大鼠致痫前后各个时期中有无线粒体遗传物质突变，有望找出新的遗传易感/致病突变基因。本项目从遗传基因水平、蛋白表达水平以及在体功能水平，首次全面探讨线粒体功能障碍在MTLE发病机制中的作用以及线粒体各功能之间的相互作用关系，并开创性地提出遗传易感因素和致痫后的线粒体基因突变参与调控MTLE慢性癫痫形成，为临床难治性MTLE的研究打开新的视角，为避免触发基因突变因素和寻求新的抗癫痫药物研发靶点提供理论依据。

MTLE是否存在遗传易感性及线粒体功能障碍在MTLE发生发展中的作用机制未见相关性研究。本项目在MTLE患者方面，完成MTLE患者临床资料、术后海马及血标本的收集、DNA 制备工作;完成磁共振波谱分析和PET-CT功能影像学检测MTLE患者的海马内能量代谢情况；完成MTLE患者术后海马标本的电镜下线粒体形态和数目检测；利用二代测序技术，完成MTLE患者和健康对照者海马组织和相应外周血的全外显子测序和线粒体全长测序，对与MTLE发病机制和线粒体功能障碍的基因进行筛选分析，发现了DNA2等与线粒体功能障碍密切相关的核基因13个、线粒体DNA单重/多重缺失5个，并进行功能整合分析，构建了与MTLE发病机制、遗传易感性以及与线粒体功能障碍密切相关的易感基因谱、线粒体DNA突变谱；进一步利用CRISPR技术，构建DNA2基因敲除的斑马鱼模型，进行表型鉴定，确认筛选基因的致病性。在MTLE动物模型方面，通过建立大鼠MTLE模型，检测MTLE动物模型急性期、潜伏期、慢性期各期的线粒体形态和数目、ATP生成率、呼吸链酶复合物活性、钙平衡、膜电位变化，明确线粒体功能障碍在MTLE发生发展各个阶段的重要作用；完成检测MTLE动物模型急性期、潜伏期、慢性期的线粒体遗传物质变化，明确MTLE海马神经元存在继发线粒体DNA突变；在癫痫细胞模型方面，完成原代培养大鼠海马神经元，建立癫痫细胞模型；完成体外细胞模型神经元放电的数目及幅度检测；完成体外细胞模型神经元线粒体膜电位和钙稳态检测。从细胞层面上，验证了癫痫细胞模型电生理和线粒体功能障碍的相关性。本项目从遗传基因水平、在体以及离体功能水平，首次全面明确了线粒体功能障碍在MTLE发病机制中的作用以及遗传易感因素和致痫后的线粒体DNA突变参与调控MTLE慢性癫痫形成，为临床难治性MTLE的研究打开新的视角，为寻求新的抗癫痫药物研发靶点提供理论依据。