益气扶正法对三阴性乳腺癌Akt/mTOR信号通路的影响

This research is based on the “Yiqi Fuzheng” principle of traditional Chinese medicine(TCM) on breast cancer,according to the prestigious doctor's long-term accumulation clinical experience and theory. Triple negative breast cancer（TNBC） is characterized by poor prognosis. To observe the "Yiqi Fuzheng “principle on TNBC，in vivo and in vitro Models are established. The Akt/mTOR signaling pathway is frequently activated in TNBC patients,and it is related to the development, recurrence and metastasis of tumor.In order to seek the molecular targets that “Yiqi Fuzheng” principle on TNBC, real-time PCR and western blot are used to detect the mRNA and protein expression of Akt、 mTOR、 PTEN;By siRNA,we further verify the key targets.We will explore the mechanism of “Yiqi Fuzheng”principle onTNBC from molecular level,and the follows are observed:what is the difference between “Yiqi Fuzheng” principle and everolimus(mTOR inhibition)? By means of a series of experiment ,thus we can provide valuable experimental basis for the clinical use of “Yiqi Fuzheng” principle on TNBC.

本研究基于名中医长期积累的益气扶正法治疗乳腺癌的理论和实践，选择临床预后不良的三阴性乳腺癌为研究对象，通过体内外实验观察益气扶正法对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468及其裸鼠移植瘤模型的影响；从与三阴性乳腺癌发展、复发、转移密切相关的Akt/mTOR信号通路着手，运用real-time PCR、western blot等方法检测该通路中Akt、mTOR、PTEN等关键分子基因和蛋白水平，以寻找益气扶正法治疗三阴性乳腺癌的分子靶点；再采用siRNA干扰技术沉默靶基因来确认作用靶点；同时比较益气扶正法与mTOR抑制剂依维莫司的作用差异。从而探讨益气扶正法治疗三阴性乳腺癌的作用机制，为目前尚缺乏针对性治疗的三阴性乳腺癌开拓临床治疗途径、提高临床疗效而提供有价值的实验依据。

本研究基于名老中医陆德铭教授长期积累的益气扶正法治疗乳腺癌的理论和实践，以预后不良的三阴性乳腺癌为研究对象，体内外实验观察益气扶正法对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468 及其裸鼠移植瘤模型的影响；从Akt/mTOR信号通路着手，运用real-time PCR、western blot等方法检测该通路中Akt、mTOR、PTEN等关键分子基因和蛋白水平，以寻找益气扶正法治疗三阴性乳腺癌的分子靶点；再采用siRNA干扰技术沉默靶基因来确认作用靶点；同时比较益气扶正法与mTOR抑制剂依维莫司（Everolimus）的作用差异。结果：1. MTT法观察以黄芪、党参为主要成分的益气扶正复方（复方）单独作用于三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞株，发现复方对其有增殖抑制作用，复方与Everolimus联合使用具有协同作用，对细胞的增殖抑制作用更为明显（P<0.05）。2. 流式细胞术检测复方组、Everolimus组的细胞凋亡率分别为20%、26%，而联合运用后细胞凋亡率增加至41%。细胞周期实验显示复方组S期细胞减少了18%，Everolimus组联合组分别使G2/M期和S期减少了11%和15%。3.复方组及联合组都能抑制p-mTOR和p-Akt、p-70s6k的活性，提高了PTEN、p-4EBP-1的表达，同时能明显降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提高促凋亡蛋白Bax的表达，激活Caspase-3。4.运用siRNA技术将Akt沉默后，复方组与联合组对PTEN、Akt、p70s6k、4EBP-1的调控作用被阻断。5.体内实验结果显示复方组能抑制肿瘤生长，联合组较复方组能更显著地抑制肿瘤生长。同时各药物干预组对动物体重均无明显影响。6. PCR、Western blot结果显示各组均能上调PTEN、4EBP-1，同时调控mTOR及下游基因p70s6k的基因及蛋白表达，联合组的调控作用更为明显，体内实验结果与体外实验结果一致。结论：益气扶正中药复方能增加Everolimus的抑瘤作用，其作用机制可能是将细胞阻滞于G0/G1期，通过调控凋亡蛋白Bcl-2及Bax的表达、激活Caspase-3有关；同时通过Akt为作用靶点来提高PTEN、p-4EBP-1的表达、抑制p-mTOR和p-Akt、p-70s6k的活性来增加依维莫司的抑瘤作用。