绵马贯众素及其衍生物抗高致病性禽流感H5N1病毒活性的定量构效关系及免疫机制研究

The research of antiviral agents has become a hot spot because of the recent epidemic of avian influenza all over the world. Mianma Guanzhong is a traditional chinese herb. Its main active compound is dryocrassin, a tetrameric phloroglucinol, according to literatures. Our research group has prepared dryocrassin and its derivatives from Mianma Guanzhong and has tested its antiviral (H5N1) activity on mice. The results showed that it has antiviral (H5N1) activity. Therefore, this proposal is planed to seperate dryocrassin and modify its structure to get more stable and more water soluble derivatives of tetrameric phloroglucinols, and then test their antiviral (H5N1) activity one by one. Furthermore, the preferred conformations and structure parameters of tetrameric phloroglucinols can be gained with quntum chemistry method and molecular graphics technique, then to explore the quantitative structure-activity relationships of the tetrameric phloroglucinols from the types, the numbers, and the locations of substituted groups by using multiple linear regression analysis method and a CoMFA model can be established. Moreover, a new tetrameric phloroglucinol compound with high antiviral activity can be designed according to the CoMFA model and it will be prepared by modify the structure of the isolated compound from Mianma Guanzhong. Its antiviral (H5N1) activity will be confirmed by in vivo and in vitro experiments and its immune mechanism will be explored. All these research results will benefit to the devolopment of a new tetrameric phloroglucinol drug with high antiviral(H5N1) activity.

近年世界各地禽流感的流行使抗病毒药物研究成为热点，绵马贯众为传统清热解毒中药，现代药理实验研究表明其所含间苯三酚四聚体化合物绵马贯众素为其主要活性成分。本课题组在前期研究中从绵马贯众中分离制备了绵马贯众素ABBA及其同系物，并且体内实验已证实了其抗高致病性禽流感H5N1病毒的活性，因此本项目拟对绵马贯众素进行结构优化，改善其稳定性和溶解性，制备系列衍生物，并进行抗H5N1病毒活性测定，进而利用量子化学法和分子图形学技术获得间苯三酚四聚体的优势构象和结构参数，采用多元线性回归分析研究间苯三酚四聚体母核上取代基种类、数目和位置的不同与其抗病毒活性的定量构效关系，构建CoMFA模型，设计目标化合物，进而优化分得化合物的结构，制备目标化合物，并对其进行体外和体内抗H5N1病毒活性的验证及免疫机制探讨，以期寻找到具有高效抗禽流感病毒活性的间苯三酚四聚体化合物，为研发抗高致病性禽流感病毒药物奠定基础。

为了从绵马贯众中筛选出抗高致病性禽流感病毒H5N1活性最强的间苯三酚类化合物，采用分子对接技术对文献报道从绵马贯众中分离得到的23个间苯三酚类化合物进行了抗H5N1神经氨酸酶（Neuraminidase, NA）活性筛选，结果表明23个间苯三酚类化合物与NA均有较低的结合能 (-6.8至-8.3 kal/moL，且均低于奥司他韦)，提示它们对NA均具有一定的抑制作用。经构效关系分析发现，其结构中的羰基和羟基是不可缺少的活性基团，二者数目越多，酰基侧链越短，活性越强；母核不宜超过四个环，环数太多则难以进入NA活性空腔。综合分析不同环数间苯三酚与NA的三维结合模式，及NA上与其作用的重要氨基酸残基，其活性由强到弱次序为：四环 > 三环 > 两环 > 五环 > 单环，因此最终筛选出6个活性最好的候选化合物。课题组同时对绵马贯众药材进行了提取分离，制备得到间苯三酚类新化合物2个、已知化合物11个（包含6个候选化合物）。为了验证分子对接实验结果，采用免疫荧光法对6个候选化合物和2个新化合物进行了抗NA活性实验，结果显示绵马贯众素ABBA和绵马酸ABA具有较强活性。为了探索绵马贯众素ABBA和绵马酸ABA是否具有直接杀灭H5N1病毒的作用，采用MDCK细胞进行了体外抗病毒实验，结果表明绵马贯众素ABBA在体外具有直接抗病毒活性。在此基础上，又对感染了H5N1病毒的小鼠灌胃给药进行治疗实验，结果表明该化合物可明显提高感染H5N1病毒小鼠的存活率，降低感染病毒小鼠肺部病毒载量和肺指数，提高小鼠体重，且呈现良好的量效关系，其作用全部优于阳性药金刚烷胺，进行该实验的同时对其作用机理也进行了初探，表明绵马贯众素ABBA可通过调节多种细胞因子的表达来减轻感染病毒小鼠的肺部炎症。因此，通过本项目的研究寻找到了具有高效抗禽流感病毒活性的间苯三酚四聚体化合物绵马贯众素ABBA。为了探索该目标化合物的安全性，采用MDCK细胞和小鼠进行了毒性试验，结果表明绵马贯众素ABBA在正常剂量下安全性良好。以上研究结果为研发抗高致病性禽流感病毒药物奠定了坚实的基础。