基于蜘蛛牵引丝CTD的双重温敏水凝胶性质调控和功能化研究

As a unique system that is genetically encoded to regulate the structure and function of materials, protein hydrogel is emerging as one of the hot topics in the study of biomacromolecules. Until now, only a few types of protein hydrogels have been reported and there is a lack of effective approaches to explore the gelling peptide modules from the structurally and functionally diverse natural proteins, tune the properties, and eventually functionalize the resulting hydrogels. To address this need, we will establish a novel gelation platform based on the carboxyl-terminal domain (CTD) of spider dragline silk that tends to dimerize for physical cross-linking. The recombinantly produced CTD will be prepared for the formation of dual thermosensitive hydrogels exhibiting a unique, sequential gel−sol−gel transition. The gelation mechanism will be elucidated by studying the impact of varying physiochemical factors on the gelation behaviors of the wild-type and variants with mutations in specific amino acid residues of CTD. Through genetic fusion of other structural or functional proteins, novel protein hydrogels with tunable properties and functions will be constructed. This project not only helps to expand the exploration of functional gelling modules from natural proteins but also reveal the molecular mechanisms in the formation of macroscopically ordered structures in dual thermosensitive protein hydrogels, thus offering a new means for de novo design and synthesis of stimuli-responsive protein hydrogels.

蛋白质水凝胶是以基因编码的方式去调控材料结构和性能的独特体系，成为生物高分子研究的热点之一。目前已报道的蛋白质水凝胶种类有限，缺乏从结构功能丰富的天然蛋白质库中发掘可凝胶化肽段模块并实现其凝胶改性及功能化的有效手段。本项目基于蜘蛛牵引丝蛋白羧基端结构域（CTD）二聚化物理交联特性，通过基因工程方法合成CTD重组蛋白形成独特的水凝胶—溶液—水凝胶双重温敏转变，通过探究不同理化因素对野生型CTD及其氨基酸序列中特定位点突变体成胶行为的影响解析成胶机理，通过嵌段融合他种结构或功能蛋白构建性能和功能可精细调控的新型蛋白质水凝胶体系。本研究的开展，不仅有助于丰富从天然蛋白质中发掘可凝胶化功能模块的尝试，还有助于理解蛋白质双重温敏水凝胶宏观有序结构的分子基础，为从头设计合成刺激响应性蛋白质水凝胶提供新思路。

作为以基因编码的方式去调控材料结构性能的独特体系，基因工程蛋白水凝胶具有很多不可替代的优势。基于已知的可凝胶化和环境应激肽段，科学家可常规性地设计制备刺激响应性蛋白水凝胶。然而，在本项目开展之前，可用于水凝胶构建的肽段模块种类非常有限，缺乏从结构功能丰富的天然蛋白质库中发掘可凝胶化肽段并实现其凝胶改性及功能化的新思路。本项目提出，在天然高分子蛋白材料形成过程中，发生二级结构的转变及物理交联的各个功能结构域，很可能是最容易挖掘可凝胶化肽段的“宝藏”。本研究以“生物钢”蜘蛛牵引丝为模型，发掘了感知外界环境变化、在纺丝过程中充当“分子开关”的牵丝蛋白羧基端结构域（CTD），发现了CTD 重组蛋白具有热诱导的连续的凝胶—溶液—凝胶转变，获得了高分子材料不可多得的双温响应特性。首先，我们考察了蜘蛛纺丝过程的理化因素对CTD成胶行为的影响，发现添加氯化钠或磷酸钾，以及降低pH，均可降低高温成胶温度，然而由于减弱了低温成胶的主要驱动力（分子间氢键作用），使得低温成胶温度降低或无法成胶。为了突破理化因素对成胶调控的局限，我们建立了分子动力学模拟方法，理性指导类弹性蛋白等肽段的融合来调控CTD成胶，不仅获得了更接近生理温度的双重温敏水凝胶体系，而且显著增强了所得水凝胶的力学性能，使其有潜力用于一体化的动物细胞储存和递送。研究表明，与对照细胞保存液相比，融合蛋白E16C水凝胶，不仅有利于小鼠成纤维细胞在4℃凝胶中的长时间保存，而且有利于在37℃凝胶中的注射递送，从而为当前细胞治疗中面临的储存递送问题提供一种新的解决方案 。功能模块发掘的研究思路，还启发我们从蜘蛛牵丝蛋白中发掘了中间重复结构域，进而发现其独特的液-液相分离行为，促成了在原核宿主大肠杆菌中构建功能可定制的无膜细胞区室，实现了原核无膜细胞器“从0到1”的突破。本研究的开展，不仅建立了双重温敏基因工程蛋白水凝胶的调控和应用平台，而且丰富了蛋白材料合成生物学的研究理论和实践。