体外定向蛋白剪接合成蜘蛛牵引丝蛋白研究

蜘蛛丝是一类优质的天然蛋白聚合纤维，在纺织、生物医学、军工以及航空航天等领域有着潜在的应用前景和巨大的商业价值。多年研究表明，借助基因工程技术制备蛛丝蛋白继而纺丝是目前开发"人工蛛丝"的首选策略。然而蛛丝蛋白分子量大、富含高度重复序列模块等因素严重制约着其全长编码基因的克隆与表达，成为人工合成蛛丝蛋白的天然屏障。断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接机制为蛋白质合成与加工提供了新的途径。本项目拟运用多个S1型和S11型断裂蛋白质内含子介导体外定向剪接合成蜘蛛牵引丝蛋白，从而建立一种分段表达-定向拼接的蛋白质合成与加工新技术。该技术有望解决蛛丝蛋白编码基因过长、基因主体高度重复等导致的表达效率低、删减表达以及翻译提前终止等问题，有效获取大量蛛丝蛋白，为"人工蛛丝"纺制提供充分的纺丝蛋白原液，开辟一条蛋白质合成与加工的新途径。

蜘蛛丝是一类机械性能非凡的天然蛋白聚合纤维，具有广泛的应用前景。研发人造蛛丝一直是国际性热点课题，但蛛丝蛋白分子量大、富含高度重复序列模块等因素制约了其全长编码基因的克隆与表达，阻碍了人工合成蛛丝蛋白的研究进程，成为人造蛛丝开发的瓶颈问题。本项目巧妙地借助新型断裂蛋白质内含子(Split-intein)介导的蛋白质反式剪接技术构建了体外定向剪接合成蜘蛛丝蛋白的技术平台，依此开发出符合纺丝原液标准的蛛丝蛋白制备体系，为进一步建立人造蛛丝技术平台奠定了前期基础。本项目基于前期已构建的多个S1型和S11型Split-intein，进一步经体外剪接条件优化、优选Split-intein的IN和IC端交叉反应测试以及Split-intein相邻氨基酸偏好性检测及特定剪接位点优化实验，选定了6个Split-intein SX、TX、TE3、CP、SG和RB构建了6组包含蜘蛛丝蛋白基因的重组质粒，体外剪接区段包含蜘蛛牵引丝蛋白和葡萄状腺丝蛋白的多段中部重复区片段和两端（N-/C-端）非重复区片段，最终实现3个Split-intein介导的4段体外定向拼接合成蛛丝蛋白系统，目前可表征最大分子量超过150kDa的单分子丝蛋白。基于蛛丝蛋白纺丝原液，我们尝试探索了一套合适的纺丝系统：原液浓度：45-65%(w/v)；溶剂为六氟异丙醇（HFIP）；凝固剂为甲醇溶液（含水量控制在20-40%）；纺丝速度控制在80-120μl/min。另外，为获取更多在蜘蛛丝蛋白基因信息，为仿生蛛丝开发提供基因蓝图，我们在基因克隆研究也有所突破，成功获取了一系列葡萄状腺丝蛋白（AcSp）和管状腺丝蛋白（TuSp）基因信息，囊括了新蛛亚目园蛛科全部3个亚科（金蛛亚目、园蛛亚目和棘腹蛛亚目）代表物种的基因信息，包括4条AcSp1/2和4条TuSp1基因片段。本项目尚存遗憾之处是体外剪接系统尚未突破4段以上拼接能力，一定程度上限制了超大分子量蛋白质的合成，期望在未来的研究中有所突破。