脊髓背角小胶质细胞P2Y12/P2X4受体在神经病理性疼痛中的相互作用及机制

脊髓背角小胶质细胞激活是神经病理性疼痛发生和维持的关键因素。嘌呤能P2Y12/P2X4受体均参与了痛觉信息的传导，但背角小胶质细胞的P2Y12/P2X4受体之间是否可以相互作用，共同促进小胶质细胞激活，转而参与脊髓水平痛觉信息的调制尚不清楚。本申请拟在已往对嘌呤受体研究的基础上，采用大鼠慢性坐骨神经痛模型，结合在体和离体实验，综合应用形态学、行为学、分子生物学及电生理学方法，观察：①外周神经损伤大鼠行为学变化、背角小胶质细胞活性与P2Y12/P2X4受体表达的关系；②从不同角度探讨P2Y12/P2X4受体间的相互作用对小胶质细胞活性的调节及相应的信号传导通路；③阐明P2Y12/P2X4受体间相互作用，促进小胶质细胞激活，间接影响背角星形胶质细胞活性及神经元突触传递效能及其可能机制。该项目为研发以小胶质细胞嘌呤受体为靶点的新型镇痛药提供理论基础，为神经病理性疼痛的治疗提供新的思路。

结题摘要：.根据31000497资助项目计划书，本项目完成了以下研究计划：.（一）、脊髓背角P2Y12受体参与了坐骨神经结扎大鼠神经病理性疼痛的发生与维持。.1） 制备坐骨神经缩窄性损伤（CCI）模型，观察鞘内给予不同浓度P2Y12受体拮抗剂 MRS2395 对 CCI 所致的大鼠神经病理性疼痛大鼠热痛阈变化的影响。结果表明，在术后1-7天内，随着MRS2395剂量的增加，大鼠缩足潜伏期延长更为明显。但在7天之后，大鼠缩足潜伏期延长逐渐降低。这表明，MRS2395发挥镇痛作用主要是在损伤后1-7天，随后其镇痛效应降低。此外，MRS2395给药后发挥镇痛效应在1h达高峰，然后逐渐降低。.2）免疫组化、Western blot检测P2Y12受体拮抗剂 MRS2395 对 CCI 所致的大鼠神经病理性疼痛大鼠脊髓背角Iba1、P2X4R表达变化。实验表明，鞘内注射MRS2395与CCI模型组比较,脊髓背角Iba1阳性细胞数目明显减少，其平均光密度值明显降低。脊髓背角P2X4R表达明显减少。这也说明，P2Y12受体参与了脊髓背角小胶质细胞激活；P2X4受体与P2Y12受体之间存在相互作用。.（二）、观察P2Y12受体、P2Y13受体对脊髓背角小胶质细胞功能活动的影响，并对其机理进行探讨。.1）培养纯化脊髓背角小胶质细胞，免疫荧光多重染色观察到小胶质细胞均存在P2Y12和P2Y13受体。.2）免疫组化及RT-PCR实验表明P2Y12和P2Y13受体参与了P2Y受体激动剂刺激小胶质细胞Iba1、Iba1mRNA表达上调的效应。.3）激光共聚焦表明P2Y13受体通过钙池调控钙离子通道途径参与了P2Y受体激动剂刺激小胶质细胞Ca2+动员的效应。P2Y13受体激活，影响内质网Ca2+释放，转而激活细胞膜Ca2+通道，促进细胞外Ca2+内流，随后胞浆内[Ca2+]i 上升。.4）酶联免疫吸附实验表明P2Y12和P2Y13受体参与了P2Y受体激动剂刺激小胶质细胞释放神经活性物质IL-1和IL-6，但不影响IL-10释放。