基因工程改性变异链球菌替代疗法防龋研究

变异链球菌是龋病的主要致病菌，在乳酸脱氢酶（LDH）的作用下可将糖代谢的中间产物丙酮酸还原成乳酸，使菌斑pH值下降，这是产生龋损的直接原因。LDH的活性降低或缺失会使变链菌的致龋力明显下降，达到防龋目的。但是LDH活性缺乏对变链菌具有致死效应，将运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶（ADH）基因替代变链菌的ldh基因，能够解决这一难题。变链菌表面存在一种能够通过与葡聚糖α-1，6糖苷键结合而凝聚细菌的植物血凝素（GBL），这种黏附素也被称作GbpC，在变链菌中普遍存在，在牙菌斑生物膜的形成以及其自身的黏附定植过程中发挥重要作用。编码变异链球菌GBL的gbpc基因的表达受到gcrR基因的负调节，失活gcrR基因可导致GBL的过度表达，增强黏附能力。本研究设计构建LDH-活性缺陷突变株并失活其gcrR基因，达到降低效应菌株产酸性增强其粘附定植能力两个目的。

由于变异链球菌是牙菌斑中产酸的主要成分并导致牙齿釉质脱矿，因此被认为是导致龋病的重要原因。同时变异链球菌对牙面的附着能力确保细菌不会被冲掉。根据研究，葡聚糖结合凝集素（GBL）在这一附着过程中起到非常关键的作用。GcrR基因是调节编码GBL基因表达的负向因子。本实验构建了一个gcrR基因完全被敲除的变异株称为MS-gcrR-def。这一变异株相对于野生株而言过度表达GBL并且更加容易附着在牙面上。这个RT-PCR的结果证明在变异株中的葡萄糖基转移酶D和葡萄结合蛋白C的表达都增高。附着实验说明不论是细菌之间还是细菌与六孔板孔壁之间，变异株的黏附能力都比较强，尤其是在附着早期。即使和野生株同时在表面竞争生长，由于变异株能抢先附着，变异株依然是混合牙菌斑中的明显优势菌。由共聚焦显微镜来分析变异株和野生株的生物膜结构，我们发现在前4个小时中，变异株生物膜的厚度和活细胞数量相对变异株而言数量显著增加。更另人感兴趣的是，MS-gcrR-def在培养前后ΔpH的改变比较小。综上，我们的研究构建了高黏附低产酸的替代疗法的效应株，并从体内外证实该效应株有可能开发成为防龋替代疗法的生物制品并用于控制与变异链球菌相关的龋病。