肿瘤来源细胞外囊泡（EVs）的分离及其内载mRNA基因特征分析在乳腺癌早期诊断上的探究

Among the various tumor biomarkers in liquid biopsy, tumor-derived extracellular vesicles (EVs) are regarded as the most competitive blood biomarker for ultra-early cancer diagnosis because they contain complete and stable tumor-specific genes, and their occurrence time in blood circulation is not limited by tumor size. However, the most popular EV isolation methods widely used at present cannot achieve pure tumor-derived EVs. The huge amount of noise signals in the samples is to result in serious interference to the detection of specific tumor signals..In this project, we are going to establish a bio-platform for the isolation and molecular analysis of tumor-derived EVs from patient plasma samples to realize the early diagnosis in breast cancer. For this purpose, a nanostructured microfluidic chip based on multi-marker recognition (EpCAM and HER2) will be established, and series of tests will be performed to optimize the isolation performances for tumor-derived EVs using artificial plasma samples. On the other hand, we will use the droplet digital PCR (ddPCR) for the quantification of the 8-breast cancer-specific gene panel (CD44, maspin, CXCL1, beta tubulin, N33, KRT19, MUC1, HER2). The clinical validation will be done to explore the application value of this gene panel in early diagnosis of breast cancer.

在液体活检的众多肿瘤标记物中，肿瘤来源外囊泡（EVs）内载完整稳定的肿瘤特异基因，且在血液循环中出现时机更早，被视为早期癌症诊断最有力竞争者。然而，目前热门的EVs分离方法均不能实现肿瘤来源EVs的纯化，样本存在的大量背景信号对特定肿瘤信号的检测造成严重干扰。本项目拟建立乳腺癌肿瘤来源EVs的分离及其分子分析平台，以期实现乳腺癌的早期诊断。基于此目的，本项目将构筑EpCAM和HER2双抗体识别的纳米结构微流控芯片，利用点击化学的优势将传统抗原抗体结合的EVs捕获转化为快速反应分离EVs，并探究该芯片对EVs的分离效果。随后利用微滴式数字PCR（ddPCR）对乳腺癌特异的8基因组合（CD44，maspin，CXCL1，β-tubulin，N33，KRT19，MUC1，HER2）进行高灵敏定量，对临床样本诊断进行验证，探究该基因特征对乳腺癌患者诊断的准确性，以评估其在乳腺癌早期诊断的应用价值。

在本项目中，我们通过联合共价化学介导的EV捕获/释放、多标志物抗体组合和纳米结构微流控芯片构建了用于HCC EV纯化的平台，即EV Click Chips，并将其用于早期HCC的非侵入性检测。本项目利用针对3个HCC相关表面标记物（EpCAM、ASGPR1和CD147）实现HCC EVs的靶向识别，而后借助点击化学介导的EV捕获和二硫键裂解驱动的EV释放从而实现HCC EVs的分离纯化。二氧化硅纳米结构基底（SiNWS）极大地增加了与EVs与捕获芯片的接触面积，而由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微流控混频器则有提高了HCC EVs和SiNWS之间的接触评率，进一步提高了EV捕获的性能。同时，Tz接枝的SiNWS和TCO接枝的HCC EVs之间的点击化学反应具有快速和高度特异的优势，提高了HCC EVs的捕获效率并降低了背景。随后，利用定量的方式评估了EV Click Chips的性能，并对HCC EV纯化条件进行了优化。随后，利用 临床血样中HCC EVs mRNA的量化及其用于肝癌早期诊断的价值评估。利用微滴式数字PCR（ddPCR）对本项目选定的10基因组合（GPC3、AFP、AHSG、ALB、APOH、FABP1、FGB、FGG、RBP4、TF）在临床血浆样本（HCC病人、其他癌症病人、肝病病人及健康志愿者）的诊断进行临床验证：对从健康血浆和病人血浆中分离的特异性HCC EVs进行RNA提取并利用RT-PCR进行逆转录制备cDNA，而后利用ddPCR对特定基因组合进行检测分析，验证了该基因组合对HCC患者和肝病人群、健康人及其他癌症患者诊断的准确性。已测试的158例病人血浆样品结果表明，与现有临床血清标志物AFP相比，该平台在检测HCC早期（BCLC 0-A）患者与肝硬化患者方面有显著优势（灵敏性=94.4%，特异性=88.5%），显示出对HCC进行无创早期检测的巨大潜力。