海参卵肽与钙结合模式解析及其促钙吸收机制研究

Sea cucumber (stichopus japonicus) ovum is a by-product during processing of sea cucumber and has not yet been effectively utilized. Our previous studies found that peptides hydrolyzed from sea cucumber ovum could form soluble compounds with calcium ions and thus promoted calcium absorption. However, it is still unclear of the mechanisms on binding calcium and promoting calcium absorption of peptides from sea cucumber ovum. In this study, we analyze the calcium-binding mode of peptides by comprehensively using thermodynamics, spectrography, molecular biology and molecular dynamics simulation, after purifying and characterizing calcium-binding peptides from sea cucumber ovum. Furthermore, we investigate the effect of the peptides on calcium absorption by Caco-2 and HT-29 cells. On this basis we investigate the mechanism on promoting calcium absorption of the peptides by determining the interaction between the peptides and intestinal cell membrane, analyzing conformational changes of the peptides when they interact with the membrane, and exploring pathways of calcium absorption promoted by peptides from sea cucumber ovum. This study will provide new ideas for elucidating the mechanism on binding calcium and promoting calcium absorption of peptides, and offer scientific basis for the bioavailability of calcium-binding peptides.

海参卵是海参加工过程中产生的副产物，迄今尚未得到有效的开发利用。申请人前期研究发现通过生物酶法制备的海参卵肽能与钙离子结合形成可溶性复合物，具有良好的促钙吸收能力，然而海参卵肽与钙离子的结合模式及其促钙吸收机制尚不明确。本项目拟纯化并鉴定海参卵钙离子结合活性肽，综合运用热力学、光谱学、分子生物学和分子动力学模拟等方法解析海参卵肽钙结合模式，揭示肽钙结合机制；采用Caco-2和HT-29细胞模型研究海参卵肽的促钙吸收效应；同时，通过分析海参卵肽与肠道细胞刷状缘膜的相互作用及其构象变化，探索海参卵肽经肠道细胞的促钙吸收途径，从而阐明海参卵肽的促钙吸收机制。这一研究不仅为钙离子结合活性肽的钙结合模式及其促钙吸收机制的研究提供新的思路，也为钙离子结合活性肽的生物利用提供科学依据。

海参卵是海参加工过程中产生的副产物，迄今尚未得到有效的开发利用。本项目以海参卵为研究对象，基于蛋白酶可控酶解技术、肽组学技术筛选出海参卵钙离子结合肽，联合光谱学、热力学、波谱学以及分子动力学模拟等研究手段，解析了肽钙结合模式，探讨了肽钙纳米复合物可能的形成机制；分析了海参卵源肽钙复合物在胃肠液体系中的时序性结构变化规律及其消化稳定性；基于Caco-2细胞单层模型、生长期大鼠低钙模型，研究了海参卵肽钙复合物的促钙吸收作用和生物利用；利用TMT定量蛋白质组学技术，对海参卵肽钙复合物的吸收机制进行了研究探讨。本研究从海参卵中筛选出一条含有连续谷氨酸“Glu-Glu”特征序列的七肽NDEELNK，具有较高的钙结合活性，研究显示海参卵源七肽（NDEELNK）能以1:1的化学计量比与钙离子发生结合，这种结合模式被称为“双齿”（或“螯合”）模式，即钙离子分别以单体形式与Asp和Glu的两个羧基氧原子平等地发生相互作用。然而，反应体系中的NDEELNK-calcium不能以单分子的形式存在。钙配位诱导了以α螺旋和无规则卷曲结构为主导的NDEELNK肽的自组装，从而形成具有一定晶体结构的NDEELNK-calcium纳米复合物。海参卵肽螯合钙在胃液消化过程发生解聚行为，释放钙离子，在肠液消化阶段，又重新聚合；经RP-HPLC和NanoLC-ESI-MS/MS鉴定，海参卵肽在胃肠道消化后保持较高的稳定性，释放出两个肽段（DEELNK和EELNK）和7个修饰变体。经Caco-2细胞单层模型发现，海参卵七肽钙复合物经消化后其促钙吸收能力显著增强（P<0.05）；构建大鼠低钙模型，发现进食低钙饲料并口服海参卵七肽钙复合物能显著提高生长期缺钙大鼠的血清钙含量（P<0.05），骨小梁数目和结构都得到了较好的恢复。TMT定量蛋白质组学结果发现海参卵七肽钙复合物在小肠部位中的吸收涉及到囊泡转运、旁细胞转运、自噬等。本项目不仅为钙离子结合活性肽的钙结合模式及其促钙吸收机制的研究提供新的思路，也为钙离子结合活性肽的生物利用提供科学依据。