基于微流控热泳技术的早期乳腺癌细胞外囊泡蛋白及核酸分子的可视化检测

Tumor-derived extracellular vesicles in peripheral blood carry a large number of tumor-associated molecular markers. The functional and quantitative characterization of EV surface proteins and miRNAs during formation of early-stage breast cancer is of great significance to early, precise diagnosis of breast cancer. In this project, directed thermophoretic enrichment and specific molecular recognition of fluorescent nanoprobes are integrated to develop a microfluidic thermophoretic platform. This platform can visually quantify the expression levels of EV surface proteins and miRNAs in peripheral blood with high sensitivity and high throughput, without complex pre-processing procedures. Machine learning algorithms and bioinformational techniques are employed to reveal the time-variated features of molecular expressions as well as the molecular function association in the key aspects of tumor development during early evolution of breast cancer. New molecular markers of breast cancer and their accurate association with pathology, imaging, clinical manifestations will be discovered, providing scientific basis for early and accurate diagnosis of breast cancer. Through the analysis of a large number of clinical samples, a tumor liquid biopsy based on thermophoretic EV molecular visualization is validated and a discriminant model for early diagnosis of breast cancer will be established.

外周血中的肿瘤细胞外囊泡（EV）携带了大量肿瘤相关分子标志物，针对早期乳腺癌形成过程中EV表面蛋白、miRNA的定量与功能表征，对乳腺癌早期诊断具有重大意义。本项目结合微尺度热泳定向富集与荧光纳米探针的特异性分子识别，开发微流控热泳检测系统，无需复杂样本前处理步骤，实现EV表面蛋白、miRNA的高灵敏、高通量、可视化定量检测。利用机器学习与生物信息学方法，揭示乳腺癌早期演进过程中EV表面蛋白、miRNA分子表达的时间变化规律以及肿瘤产生发展关键环节中的分子功能关联。从而发现新的乳腺癌分子标志物，建立分子病理与组织病理学、影像学、临床表现的准确关联，为乳腺癌的早期、精准诊断提供科学依据。基于大样本临床分析，验证基于微尺度热泳EV分子可视化检测的临床应用价值，建立乳腺癌早期诊断的判别模型。

本项目团队面向乳腺癌早期精准诊断的重大需求，构建基于微流控热泳的细胞外囊泡（EV）分子可视化检测新系统，发展机器学习与生物信息学方法，为乳腺癌演进过程中EV表面蛋白、RNA分子信息可视化与乳腺癌早期精准诊断提供了先进工具，取得如下创新性成果：. （1）结合荧光核酸适体识别与热泳定向富集，发展了微流控热泳生物传感新策略，实现了乳腺癌血浆样本中EV表面蛋白的原位、高灵敏、可视化检测。EV表面靶标蛋白被荧光核酸适体识别，随后通过热泳10分钟内快速汇聚EV，有效放大EV携带荧光信号。该方法无需预先分离纯化EV，利用1μL血浆样本中即可获得EV表面8种乳腺癌相关蛋白表达图谱，灵敏度比ELISA高3个数量级。进一步结合分子“与门”逻辑运算识别探针与PEG增强热泳汇聚，实现EV多种表面蛋白共表达的一步法、快速检测，可在15分钟内高特异性检测血清样本中肿瘤EV。. （2）结合功能核酸探针与热泳定向富集，发展了EV RNA的原位、高灵敏、可视化热泳检测新方法。构建的球形核酸探针与DNA四面体探针可通过被动输运方式进入EV，特异性识别靶标miRNA与mRNA后产生荧光信号。之后EV在热泳作用下快速汇聚，有效放大其携带荧光信号，实现EV RNA高灵敏检测。该方法测量结果与qRT-PCR一致，对EV miRNA的检出限为0.36fM，EV mRNA的检出限低至14aM，灵敏度与qRT-PCR相当。该方法无EV裂解、RNA提取、反转录等过程，仅需使用2μL血清即可获得多种肿瘤相关EV RNA的表达图谱。. （3）设计了一种机器学习算法，基于8种EV乳腺癌蛋白表达水平构建EV蛋白特征，用于区分转移乳腺癌（MBC）患者、非转移性乳腺癌患者、年龄配对的健康对照者，准确率高达91.1%。在训练队列、验证队列、前瞻队列研究中，EV蛋白特征可以监测MBC的治疗反应，对治疗后疾病进展（PD）与稳定/部分缓解（SD/PR）的区分准确率为88.5%。EV蛋白特征还与接受治疗的MBC患者的无进展生存期（PFS）显著相关，其中前列腺癌生物标志物EV PSMA可以作为MBC患者PFS的独立预后因素。