p38激酶-HSP27途径保护烧伤后血管内皮屏障的作用及机制研究

内皮细胞回缩是血管通透性增高的重要基础之一，其调节机制至今未明。近年，以p38激酶-HSP27-应力纤维为主线诠释内皮细胞回缩机制的观点受到挑战。结合工作基础，本项目提出p38激酶-HSP27途径是烧伤后血管内皮屏障的重要保护性适应机制的新观点。拟首先在细胞水平建立烧伤后血管内皮HSP27磷酸化、F-antin含量与形态以及通透性变化间的时间对应关系；通过上或下调细胞HSP27磷酸化水平，明确HSP27磷酸化对内皮屏障的保护作用；通过研究MK2的SUMO化修饰和PP2A对HSP27磷酸化的调节作用，初步阐明烧伤后p38激酶-HSP27磷酸化随时间削减的分子机制。在此基础上，构建穿膜蛋白TAT-磷酸化HSP27，在体验证磷酸化HSP2降低烧伤后血管通透性的重要作用，研究对进一步深入揭示烧伤后血管通透性变化的分子调节机制，从细胞内源性保护角度促成防治微血管渗漏和烧伤休克的新型策略，具有重要意义

血管通透性增高是烧伤早期休克和脏器水肿的根本原因，而内皮细胞回缩是多种病理生理（包括烧伤）条件下微血管通透性增高的重要基础。由于烧伤早期血管内皮细胞回缩的机制尚未得到充分阐明，目前临床上缺少防治微血管渗漏的有效措施。一般认为，应力纤维中F-actin与肌球蛋白相互作用是内皮细胞回缩的骨架基础，而p38激酶-HSP27磷酸化则是应力纤维形成的重要机制。然而，我们以往发现，烧伤后血管内皮通透性增高并不与应力纤维形成相平行，且内皮细胞 HSP27磷酸化水平仅短暂升高。结合近年有关磷酸化HSP27通过促进应力纤维形成降低缺氧或炎症条件下血管内皮通透性的研究发现，我们提出p38激酶-HSP27磷酸化可能是烧伤后血管内皮屏障的重要保护性适应机制的科学假设，并予以验证。.研究以烧伤患者血清为刺激因素，以大鼠肺微血管内皮细胞（RPMEC）为对象，首先观察了p38激酶-HSP27磷酸化、蛋白表达和分布与内皮细胞应力纤维形成、通透性变化的内在关系, 发现烧伤血清诱导RPMEC细胞中央型F-actin形成早于内皮通透性增高，且随后中央型F-actin趋向消失而代之以不规则的周边型F-actin。与此同时，烧伤血清刺激使RPMEC细胞p38激酶、MK2和HSP27的磷酸化增强，其中p38激酶和HSP27的磷酸化水平仅短暂升高后便迅速下降；而MK2的的磷酸化随血清刺激时间延长呈逐渐增高趋势，提示 p38激酶-HSP27磷酸化和应力纤维形成与烧伤血清诱导的内皮高通透性呈反向关系。在此基础上，我们采用基因突变技术构建磷酸化和非磷酸化HSP27表达突变体，探讨了磷酸化HSP27在烧伤后血管内皮通透性变化中的作用，发现磷酸化HSP27可显著降低烧伤血清刺激条件下RPMEC细胞单层通透性以及F-actin周边型重排和形态紊乱，促进中央型F-actin应力纤维形成，使RPMEC细胞间紧密连接完整性明显改善、细胞间裂隙减少；而非磷酸化HSP27的作用则相反，提示磷酸化HSP27具有保护血管内皮屏障的作用。最后，研究进一步证实蛋白磷酸酶PP2A促进HSP27去磷酸化和SUMO化修饰抑制MK2的活性是烧伤血清刺激条件下RPMEC细胞p38激酶-HSP27磷酸化随时间削弱的重要调节机制。研究对深入揭示烧伤后微血管通透性变化的分子机制，从细胞内源性保护角度促成防治烧伤肺微血管渗漏和烧伤休克的新型策略，具有重要意义