NCOA5通过调控FOXA1表达影响人肝细胞癌发生及其机制研究

Hepatocellular carcinoma(HCC) significantly correlates with type 2 diabetes and gender disparity. The underlying mechanism is not quite clear yet. NCOA5 is a coactivator independent of AF2, which influences both HCC and T2D. Previous study had showed that NCOA5 haploinsufficiancy increase glucose intolerance as well as HCC in male mice. Mechanism partially includes activate IL-6 and its function. Our further study show overexression of NCOA5 can downregulate FOXA1 expression in cells. FOXA1 is a key regulator of maintaining blood glucose of dynamic balance and gender differences of HCC. Hence, using HCC cell lines, animal tumor model and clinical specimens, this project aims to to discuss the inhibitory effect of NCOA5 in human HCC and molecular mechanisms of NCOA5 down-regulating FOXA1 expression resulting HCC. Moreover, RNA-seq was used to explore other new NCOA5 downstream signaling molecules. This project will provide new evidence for the pathogenesis of HCC and T2D, mechanisms of gender disparity in HCC , even a new target for HCC prevention and treatment.

肝细胞癌（HCC）与2型糖尿病（T2D）和性别有显著关联，但其中的机制仍不明确。NCOA5是独立于AF2、同时影响肝癌和T2D的共激活因子。我们的前期研究已经表明，NCOA5单倍体功能不足导致雄性小鼠发生葡萄糖耐量异常以及HCC，其中部分机制包括调控炎症分子IL-6的表达及功能。我们进一步研究发现肝癌细胞株过表达NCOA5能导致FOXA1的表达下调，而FOXA1是维持血糖动态平衡和影响肝癌发生性别差异的关键分子。因此，本项目将利用肝癌细胞、动物成瘤模型和临床标本，从细胞到整体水平进一步研究NCOA5抑制人HCC发生的作用，阐明NCOA5通过下调FOXA1表达影响肝癌发生的分子机制，同时应用高通量RNA定序分析（RNA-seq）探索NCOA5的其它下游信号分子。本研究将为HCC和T2D的关联、HCC发生的性别差异提供新的理论依据，有望为HCC的防治提供新的靶点。

肝细胞癌（HCC）起病隐匿，多数患者就诊时已是晚期。而晚期肝癌系统治疗手段非常有限且疗效欠佳。目前分子靶向治疗仍是肝癌系统治疗未来的方向，但是新分子靶点的发现，将依赖于HCC发病机理的深入了解。因此，本项目主要通过探讨NCOA5及FOXA1在肝癌发生发展中的分子机制，以期为肝癌的分子靶向治疗提供理论基础。本项目研究内容主要包括两个方面：1. 前期研究发现NCOA5不同表达水平对肝癌细胞可能发挥不同的影响。本项目通过研究NCOA5敲除对人肝癌细胞上皮间充质转化（EMT）作用及肝癌伴糖尿病患者NCOA5非同义单核苷酸位点变异（SNV）对肝癌细胞周期的影响来进一步探讨NCOA5的功能； 2. 前期研究显示 FOXA1可能是候选的抑癌基因，本项进一步研究FOXA1对肝癌细胞增殖及侵袭转移的影响及其分子机制。本项目重要研究结果：1. 应用Crispr/cas9技术获得NCOA5基因敲除肝癌细胞；功能试验显示NCOA5敲除可以抑制肝癌细胞的增殖及侵袭迁移能力；应用RNA seq检测并行聚类分析结果显示EMT相关基因发生改变。Western blot检测发现NCOA5敲除后，E-cad表达上调， N-cad表达下调。2. 我们在对人糖尿病肝癌组织测序分析发现了NCOA5 转录抑制区域（第445位点）存在一个非同义单核苷酸变异位点（SNV），由GCG替换为ACG，相应的氨基酸由苏氨酸（thr）变化为丙氨酸（Ala）。研究发现NCOA5高表达会引起肝癌细胞增殖减慢、细胞周期G2/M期阻滞、细胞DNA损伤增多及细胞衰老增多。但NCOA5T445A高表达会丢失NCOA5对肝癌细胞株的影响。3. 我们通过在肝癌细胞中过表达或抑制FOXA1的表达，发现FOXA1能抑制肝癌细胞增殖、侵袭及迁移能力。ChIP和双荧光素酶报告基因检测提示FOXA1能直接结合于PIK3R1启动子，抑制其转录活性，从而抑制PI3K/AKT通路活性，发挥抑制肝癌细胞侵袭转移的能力。在男性肝癌组织进一步证实FOXA1与PI3Kp85呈负相关，且低表达PI3Kp85的患者预后更好。本项目通过研究NCOA5及FOXA1在肝癌中的作用，以期为HCC发病机制提供新的认识，为寻找新的分子靶点提供理论依据，为优化晚期HCC的分子靶向治疗提供实验依据。