大白菜复等位基因雄性不育系统育性调控的分子机制研究

The development of plant stamen is regulated meticulously by a complex gene network, and any node gene mutation in the network may cause tremendous variation in transcriptome and proteome，which may lead to male sterile occur of plant. In this study, a multiple allele inherited male sterile line of Chinese Cabbage, which was firstly found by the applicant, will be used as test material and RNA-seq and Small RNA-Seq techniques based on the second generation sequencing platform will be applied to analyze the bud transcriptome of the male sterile system and identify the different in the expression in mRNA and miRNA between the male sterile plants and the male sterile ones. Meanwhile, the differentially expressed proteins between the fertile plants and the sterile plants will be identified through the analysis of the bud proteome of the male sterile system by use of 2D-DIGE techniques combined with mass spectrometry. The metabolic and signaling pathways related to the fertility regulation could be predicted by contrasting the changes between the transcriptome and proteome, and consulting the bioinformatics data base. These studies are aimed to explore the fertility regulation mechanism of the multiple allele male sterile system in Chinese cabbage through the analysis of the transcriptome, proteome and metabolism. The findings will be valuable for further developing the precious genetic male sterile resources and provide valuable information for understanding the gene regulatory network in stamen development.

植物雄蕊发育受复杂的基因网络精细调控，一些重要节点基因发生突变，会导致转录组和蛋白质组发生巨大变化，从而造成雄性不育。本项研究拟以申请者首先发现的大白菜复等位基因遗传的雄性不育材料为试材，利用基于第2代测序平台开发的RNA-Seq和小RNA测序技术，对该不育系统的花蕾转录组进行深度测序，发掘在可育株与不育株之间差异表达的mRNA和microRNA；同时，利用2D-DIGE技术结合质谱对该不育系统的花蕾蛋白质组进行平行分析，鉴定筛选可育株与不育株差异表达蛋白。在上述研究基础上，对比转录组与蛋白质组相应的变化，采用生物信息学分析方法，预测与该不育系统育性调控相关的代谢途径和信号通路，在转录组、蛋白质组和代谢3个层面协同分析大白菜复等位基因雄性不育系统的育性调控机制。研究结果对于更好的开发利用这一珍贵的大白菜雄性不育遗传资源具有重要意义，同时可以丰富植物雄蕊发育基因调控网络的知识。

大白菜是完全花异花授粉作物，具有明显的杂种优势。在配制杂交种的过程中，雄性不育材料的利用是一种较好的杂交制种途径。大白菜雄性不育遗传机理和分子机制研究一直是人们关注的热点。在本项研究中，以大白菜复等位基因遗传的雄性不育材料为试材，通过对雄性不育“两用系”可育株（MsfMs）与不育株（MsMs）花蕾进行转录组测序，找出差异表达基因并分析它们的功能和参与的代谢途径，在1013个差异表达基因中，有475个基因仅在可育花蕾中表达，6个基因仅在不育花蕾中表达，其中82个特异性表达基因功能未知但大部分在花粉中表达，筛选出与花粉发育相关的AMS、MS2、VGD1以及果胶酶类基因等等；通过smallRNA测序，筛选出19个差异表达的miRNA，这些差异表达的miRNA的靶基因，部分与花、雄蕊、花粉的发育相关，其中有5个miRNA的靶基因在转录组测序中也为差异表达基因，除此之外，还预测到46个新的miRNA，并对35个已知的miRNA进行了靶基因预测；利用iTRAQ技术检测蛋白质组，获得1494个差异蛋白，包括749个上调蛋白和745个下调蛋白，其中，筛选到30个与花粉细胞壁相关的差异蛋白和12个与花药花粉发育相关的差异蛋白；在转录组分析获得的差异表达基因中，选取10个功能未知的差异表达基因，并且它们在可育花蕾中特异表达，在转录水平上分析它们的表达模式和序列特征，选取其中的4个基因对其启动子进行克隆，构建表达载体，利用转基因技术将其转化到拟南芥中进行功能验证，通过对转基因植株进行PCR分析和GUS染色检测，证明目标基因已经成功转入拟南芥，转化的4个基因的启动子均在花药中表现特异性表达，说明其相应的基因与大白菜雄蕊育性调控有关。这些研究结果可以为筛选鉴定大白菜核不育复等位基因（Ms、Msf和ms）奠定基础，并为核雄性不育相关基因、miRNAs和蛋白的研究提供了数据库，有助于揭示大白菜雄性不育的分子机制。