大白菜雄蕊育性调控机制研究

The multiple allele inherited male sterile materials with 100% sterile plants of Chinese cabbage was firstly found by the applicant, which is the important genetic resources of heterosis utilization and the precious materials for probing stamen fertility regulation in plants. In our previous studies, the male sterile gene Ms was mapped on the A07 chromosome, and local inversion and large fragment insertion happened in the mapping region, and the Ms gene was located on the 54.5kb of inserted fragment. Since the highly homologous sequence of the inserted fragment has not been found in Arabidopsis thaliana, which suggested that it may be the specific genetic mechanism of Chinese cabbage. In this project, the three multiple alleles Ms, Msf and ms will be cloned, and their function will be identified using the transgenic technology; The interacting mechanism of the multiple alleles will be explored using BiFC technology; The up- and down-regulation genes and interacting proteins will be separated using Yeast two-hybrid, ChIP-seq, BiFC, and EMSA technology. The regulatory network of stamen fertility based on the sterile site will be established. The research results will contribute to reveal the regulatory mechanism of stamen fertility of the multiple allele inherited male sterile line, and provide knowledge accumulation for the artificial control of stamen fertility.

申请者首先发现的具有100%不育株率的大白菜复等基因遗传的雄性不育材料，是杂种优势利用的重要遗传资源，也是植物雄蕊育性调控研究的珍贵材料。申请者前期已将该不育源的雄性不育基因Ms定位于大白菜A07染色体，并发现定位区间内发生了局部倒位和大片段插入事件，Ms处于54.5kb插入区段上。由于在拟南芥中没有找到该区段的高同源序列，预示其可能是大白菜特有的遗传机制。本项目拟进一步克隆该位点的Ms、Msf和ms等3个复等位基因，利用转基因技术鉴定其功能；利用BiFC等技术鉴定复等位基因之间是否存在直接互作；利用酵母双杂交、ChIP-seq、BiFC以及EMSA等技术分离其上、下游基因以及互作蛋白，绘制围绕该位点的雄蕊育性调控网络。本项目研究结果有助于揭示该不育源的雄蕊育性调控机制，为最终实现雄蕊育性的人工调控提供知识积累。

大白菜是两性花异花授粉作物，具有显著的杂种优势，雄性不育系的利用是其理想的杂交制种途径。1992年，申请者发现了一份复等位基因遗传的大白菜核不育材料，测交筛选到了具有100%不育株率的雄性不育系，并提出了“大白菜核基因雄性不育复等位基因遗传假说”，实现了奶白菜、紫菜薹、乌塌菜和白菜薹等多种白菜类蔬菜的定向转育。本研究前期开发了多个与核不育基因Ms连锁的分子标记，将Ms基因定位在A07染色体上。通过对大白菜雄性不育株（MsMs）的BAC文库进行筛选、测序和拼接，发现在不育基因定位区域有大片段的倒位和插入，预示该育性位点可能存在着复杂的结构变异。.本研究以遗传稳定的雄性不育“两用系”的不育株‘AB03-S’（MsMs）与恢复系‘AB04-F’（MsfMsf）为亲本，构建F2分离群体，将Ms基因定位于A07染色体的231.3kb区域，包含21个基因，结合亲本全基因组重测序分析，发现在不育株中只有BraA07g008890.3C的外显子区存在一个InDel，其编码FHA结构域调控蛋白，预测BraA07g008890.3C为Ms候选基因。在‘AB03-S’中，BraA07g008890.3C的第三个外显子有一个9bp的碱基序列插入，其中包含一个终止密码子，导致翻译提前终止。连锁分析结果显示该InDel与雄性不育性状共分离。通过拟南芥异源转化功能互补实验，证明了白菜可育亲本的BraA07g008890.3C基因，可以恢复拟南芥同源基因突变体的雄蕊育性，从而验证了其功能。启动子活性分析证明了BraA07g008890.3C主要在花器官中表达。qRT-PCR分析表明BraA07g008890.3C在可育花蕾中的表达量显著高于不育花蕾，且在雄蕊中高表达。MsfMsf与MsMs花药转录组分析发现，BraA07g008890.3C在MsfMsf花药中的表达量明显高于MsMs。MsfMsf和MsMs花药之间的大部分差异表达基因显著富集在植物-病原相互作用、苯丙烷生物合成、MAPK信号通路及淀粉和蔗糖代谢相互转化代谢通路。对大白菜和奶白菜的Msf、Ms和ms纯合体材料进行二代和三代重测序，获得了不同基因型及不同遗传背景材料间的序列差异信息，发现了白菜核不育复等位基因定位区域存在大片段的倒位和重复，揭示了Msf、Ms和ms三个复等位基因互作调控雄蕊育性的分子机制。