野西瓜水溶性生物碱和脂溶性生物碱抗肝癌活性的比较研究

本项目发现民族药野西瓜新的药理作用-抗肝癌活性并野西瓜中水溶性生物碱和脂溶性生物碱抗肝癌活性的比较研究，找出野西瓜生物碱的结构与抗肝癌活性的关系。本课题组前期研究成果均显示：野西瓜生物碱体内和体外均具有抗肿瘤活性，对肝癌尤其敏感。本课题采用活性追踪方法从野西瓜生物碱中提取分离得到抗肿瘤活性成分。体内实验 ，采用S180、H22、EAC三个肿瘤模型共同考察野西瓜生物碱的体内抗肿瘤作用。体内外实验，以人肝癌HepG-2细胞为研究对象，研究野西瓜水溶性生物碱和脂溶性生物碱诱导凋亡、周期阻滞的作用机制，明确死亡受体通路和线粒体通路是否参与此过程，观察p53、bcl-2/bax和p21在野西瓜不同极性生物碱诱导HepG-2细胞凋亡及周期阻滞过程中所发挥的作用。通过分离得到野西瓜水溶性生物碱和脂溶性生物碱的抗肝癌活性的比较，寻找结构和活性的内在联系。

本项目对民族药野西瓜抗肿瘤活性成分及其作用机制进行了深入的研究，完成以下四方面的工作：（1）确定生物碱类成分是野西瓜抗肿瘤的活性成分，并对分离得到的水溶性生物碱和脂溶性生物碱的抗肿瘤活性进行了比对，发现水溶性生物碱的抗肿瘤活性较突出，接下来采用活性跟踪的方法分离得到具有较强抑制肿瘤细胞增殖的组分——野西瓜极性生物碱A10组分，并找出其敏感细胞株为SGC-7901。（2）研究了A10组分对SGC-7901细胞的生长抑制作用及诱导凋亡作用及其分子机制，通过MTT实验、SRB实验和集落形成率实验发现A10组分对SGC-7901具有生长抑制作用；利用荧光显微镜法和透射电镜法判定了SGC-7901凋亡形态；经PI单染法和Annexin V-FITC/PI双染法发现A10组分具有诱导SGC-7901细胞凋亡的作用；然后对A10组分所诱导SGC-7901细胞凋亡线粒体通路的关键事件进行研究，包括MPTP孔开放程度、膜电位丧失、Cyt-c释放、Caspase-9及Caspase-3激活，确定了A10组分通过线粒体途径诱导凋亡，并对凋亡调控因子如活性氧水平、Ca2+浓度进行检测，判断出ROS积聚和钙超载参与了A10组分所诱导线粒体凋亡通路的调控。最后，对线粒体凋亡通路调控基因Bcl-2和Bax在蛋白表达水平和mRNA基因转录水平上分别利用Western Blot法、流式细胞术和RT-PCR法进行检测，揭示了A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡的线粒体通路。（3）对野西瓜抗肿瘤活性成分进行了分离纯化，反复运用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、重结晶等方法进行分离纯化。根据分离所得化合物的理化性质，结合核磁共振氢谱（1H-NMR）、核磁共振碳谱（13C-NMR）以及质谱（MS）等光谱数据分析及采用核对文献等方法对化合物的进行结构鉴定，得到7个化合物，其中化合物7为首次从野西瓜中分离得到的已知的生物碱类化合物。（4）作为该项目的补充内容，课题组还发现了野西瓜乙酸乙酯部位对阿霉素心脏毒性具有保护作用，其作用机制与抗氧化活性，消除自由基、增强抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化，改善能量代谢、降低自由基产生大量活性氧等有关，并分离纯化野西瓜抗氧化活性物质。.本课题共培养博士研究生1名，硕士研究生11名，共发表论文13篇，期刊论文9篇，会议论文4篇，其中EI检索3篇，SCI检索2篇。