miR394调节油菜耐镉机理及新候选miRNA的鉴定

为了阐明miRNA调节植物对重金属胁迫反应的分子机理，本项目将鉴定油菜中对Cd胁迫响应的miR394。主要构建miR394及其靶基因过表达转化载体，miR394基因沉默及其靶基因定点突变表达载体以及靶基因突变体回补载体等，转入油菜体内。鉴定和分析各类转基因植株和突变体中miR394及其靶基因的时空表达模式，分析各转基因植株和突变体在Cd胁迫下的生长以及对Cd吸收和积累特性的变化。分离miR394及其靶基因上游启动子序列，构建启动子表达转化载体，研究和分析miR394及其靶基因在不同组织中的原位表达。最后，从Cd胁迫处理过的油菜中分离18-26 nt小分子RNA。采用第二代测序技术（Deep-seqencing）对小分子RNA进行高通量测序,获得新的候选miRNA基因,并对之进行基因芯片或高通量PCR验证。通过生物信息学方法解析油菜对Cd胁迫响应的信号转导途径及miRNA分子调控网络。

本项目以油菜（Brassica napus）等为材料，研究miR394及其靶基因LCR对Cd等非生物胁迫反应的生理功能进行了鉴定。主要工作包括：1. 构建了油菜和拟南芥miR394a/b及其靶基因各种转化材料，包括：35S::miR394a，35S::anti-FBOX，35S::m6FBOX（靶基因点突变过表达植株）及35S::FBOX（靶基因非点突变过表达植株，作为对照）。上述植株中35S::miR394a已获得T3代用于功能鉴定。2. 鉴定和分析miR394及其靶基因调节油菜对Cd吸收、转运、积累和耐性机制，初步鉴定了miR394靶基因F-box蛋白调控与Cd吸收和积累相关的转运蛋白等基因表达的分子机理。通过酵母双杂交等技术已经筛选到可以被LCR (F-box) 泛素化修饰互作的二个候选的蛋白质。其中一个为膜转动蛋白质，已有资料证明其参与调控Cd的吸收、转运和耐性过程。3. 鉴定和分析对Cd胁迫响应的新的候选miRNA基因，获得了大量的能对Cd胁迫响应的miRNAs。同时，通过降解组研究发现了一些重要的miRNA靶基因，而这些基因对调控植物对Cd的胁迫反应具有重要的理论研究价值。4. 研究表明miR394及LCR具有新的功能，包括：a. miR394及其LCR参与调节叶片卷曲，两者对调控叶片形态的正常发育是必需。b. miR394及LCR参与调节植物对非生物胁迫（盐害、干旱和冷害）的响应，并依赖于ABA的作用。目前已完成相关SCI论文4篇，总影响因子为18.163，其中一篇最高影响因子的论文为5.242。