比格犬耐应激的miRNA鉴定及分子调控机制研究

实验动物应激反应的发生是一个复杂的神经内分泌过程，不利的应激会影响到实验动物的健康和动物实验的科学性。国内外研究表明 miRNA在动物应激反应发生过程中具有重要的作用，而下丘脑-垂体-肾上腺轴是应激反应发生的重要通路。本研究拟通过比较耐应激的比格犬和易应激的普通犬，在应激各阶段的下应激轴重要组织开展miRNA测序和数字基因表达测定，分析品种间的表达差异，结合生物信息学分析，筛选比格犬耐应激的特征性miRNA和相应靶基因，并通过蛋白、细胞等水平加以鉴定；筛选这些miRNA的编码区和调控区 DNA序列多态性，结合各种SNP功能鉴定方法和进化理论的分析方法，对带有Effective SNP的实验犬给予相同的应激处理，检验遗传标记的有效性，最终鉴定耐应激的eSNP，揭示其调控应激的作用机制。本项目旨在认识犬应激轴的miRNA作用通路和分子调控机制，对培育抗应激品种（系）具有潜在的应用价值。

过度的应激不仅会影响到动物的健康和还会对动物实验的科学性产生影响。本项目以耐应激的比格犬和耐应激力较差的土狗为研究对象，采用耳部电刺激方法，分别对3只比格犬及3只土狗进行应激处理10天，同时设定对照组。应激处理后采集垂体和肾上腺皮质，抽提组织RNA，对同品种、同组织样、同处理组进行RNA混池。对RNA混池进行RNA-seq及siRNA-seq以探寻HPA轴上调控应激相关的miRNA和mRNA。RNA-seq测序结果表明，在BP1_vs_BP2，CFDP1_vs_CFDP2，BP1_vs_CFDP1，BP2_vs_CFDP2，BAC1_vs_BAC2，CFDAC1_vs_CFDAC2，BAC1_vs_CFDAC1和BAC2_vs_CFDAC2中，表达差异显著基因数分别为40、346、376、69、70、38、57、71。通过GO、pathway、IPA等生物学软件分析的结果显示GRM5、GRIN2A、 SLC1A2和STX1A应激后表达显著上调。对同组织、应激前后、种内种间的miRNA表达量进行比较，即BP1_vs_BP2， CFDP1_vs_CFDP2， BP1_vs_CFDP1，BP2_vs_CFDP2，BAC1_vs_BAC2， CFDAC1_vs_CFDAC2，BAC1_vs_CFDAC1 和BAC2_vs_CFDAC2，结果显示各比对组中各有21、35、50、28、29、23、37和30个表达差异显著的miRNA。通过生物学软件分析，发现cfa-miR-30a、cfa-miR-34b及cfa-miR-34c在应激前后表达显著差异，可能是动物应激的特征性miRNA。对差异表达的miRNA和mRNA进行整合分析，结果显示cfa-miR-30a（-GRM5）、cfa-miR-30a（-GRIN2A）、cfa-miR-30a（-SLC1A2）、cfa-miR-34b（-STX1A）及cfa-miR-34c（-STX1A）组对可能是动物应激相关的因素。对高通量测序结果进行qPCR验证，结果也显示各差异基因的表达差异倍数相似，miRNA与靶基因的表达量也呈现负调控关系。因此，cfa-miR-30a、cfa-miR-34b/c可能是HPA轴上应激调控的关键miRNA,它们通过其靶基因GRM5、GRIN2A、 SLC1A2和STX1A 发挥作用。