HMT和CTF金属转运体调节水稻对镉吸收、积累及脱毒机制的研究

Overacumulation of Cd in soils is a threat to rice production and food safty. Elucidation of regulatory mechanism for Cd uptake and accumulation in rice crops is critical to ensure the crop production and food safety. We recently isolated two metal transporter genes HMT (heavy metal transporter/detoxification protein) and CTF (cadmium tolerant factor) from Cd-exposed rice plants. RNA- and Bisulfite-sequencing revealed that both HMT/CTF genes can be induced by Cd but hypomethylated in the upstream of HMT) and downstream of CTF in Cd-exposed rice. In this project, we attempt to identify functional roles of HMT and CTF in regulating Cd uptake, translocation, accumulation and detoxification in rice. Transgenic plants overexpressing HMT/CTF will be developed and mutants of HMT/CTF will be applied to the study, which includes investigating HMT/CTF-mediated Cd uptake, translocation, and accumulation in various tissues and seeds. The transgenic rice and mutants will be validated for the physiological process. Coordinated regulation of DNA methylation/demethylation of HMT/CTF, with regard to HMT/CTF expression and Cd uptake, accumulation and detoxification will be investigated. The aim of our proposal is to uncover the roles of HMT/CTF in regulating Cd uptake, translocation and accumulation in rice, and the mechanism leading the DNA methylation involved in HMT/CTF-mediated Cd uptake and detoxification as well.

农田土壤中镉（Cd）浓度超标严重影响我国水稻生产与粮食安全。本课题将对一个水稻品系中筛选得到两个对Cd高度专一的金属转运体HMT及CTF进行功能鉴定与调控机理研究。通过遗传转化及突变体鉴定HMT和CTF参与调节水稻植株对Cd的吸收、积累与脱毒效应，研究两者调节Cd在水稻不同组织和器官内对Cd转运与分配的模式。在Cd污染农田土壤中，鉴定HMT和CTF调节水稻秸秆及籽粒中Cd的富集行为。由于前期研究发现Cd暴露能改变HMT和CTF基因甲基化水平及转录表达，项目将系统研究HMT和CTF基因 DNA甲基化与去甲基化模式、基因表达及Cd吸收、积累之间的关系。项目最终将阐明HMT和CTF参与水稻对Cd吸收、积累和脱毒作用，以及DNA甲基化参与调控HMT和CTF功能的分子机理。

农田土壤中镉（Cd）浓度超标严重影响我国水稻生产与粮食安全。研究减少作物对土壤中Cd的吸收与积累，对人类健康具有重大意义。本课题针对上述环境污染现状与农业生产中出现的问题，对我国主要的粮食作物水稻中能调控Cd积累的关键基因及调节机制进行了探索性地研究。通过构建高通量DNA甲基化及转录组文库，采用重亚硫酸测序技术测定和分析了Cd处理前后水稻全基因组DNA甲基化单碱基分辨率谱图，挖掘到与Cd转运相关的两个未知蛋白质基因OsHMT和OsCTF。主要研究结果如下：. 构建了OsHMT过表达、OsHMT和OsCTF基因敲除（T-DNA）和敲低表达（RNA干涉）水稻株系, 获得了转基因及突变株系。短期和长期试验表明，OsHMT过表达能促进水稻对Cd的吸收和积累，毒性较小，而突变体中Cd的积累量较少，但毒性较大。相反，OsCTF突变体中Cd积累量较多，毒性增加，但将OsCTF回补到突变体后，植株中Cd积累量又下降，毒性也减小。上述结果表明，OsHMT是一个Cd积累脱毒型的基因，而OsCTF是一个Cd外排型的基因。.OsHMT定位于细胞质及核内，OsCTF定位于细胞质膜及内织网。金属-螯合亲和层析方法研究发现，OsHMT只与Cd和Mn结合。OsCTF转录表达只对Cd胁迫响应。因此，OsHMT和OsCTF对Cd均具有较高的专一性。. 研究了OsHMT和OsCTF基因表达受DNA甲基化调控的模式，发现在Cd处理后OsHMT基因上游5’-UTR和OsCTF基因下游3’-UTR的特定区域DNA甲基化（CG/CHG）水平下调，MET1、SDG714等基因的转录活性下降。进一步通过鉴定不同类型的DNA甲基转移酶基因突变体（Osmet1、Osdrm2、Ossdg714、Osrdr6、Osros1等），发现Osmet1和Ossdg714中OsHMT和OsCTF转录表达显著提高，表明Cd诱导的MET1、SDG714转录活性的下降是导致OsHMT和OsCTF表达的主要原因，从而进一步促进了水稻植株对Cd的耐性增强并改变水稻对Cd的积累水平。. 在网室盆栽（自然光和温度）和低Cd污染土壤区（常熟）进行了田间试验。按不同生育期收获植株，分析Cd水稻不同组织和籽粒中Cd的积累量，得到了相同的结果。此外，项目还研究了与OsHMT同家族若干个金属伴侣蛋白基因，并对其进行了功能鉴定。