雌激素相关受体及其信号通路在三疣梭子蟹卵巢发育过程中的功能探究

Estrogen is one of the important sex steroid hormones, which regulate the ovarian development of crustacean. In vertebrates, estrogen need bind its receptor to active the response genes, however, up to date there is no study on estrogen receptor (ER) in crustacean, indicating the existence of other receptor in the estrogen activation. Estrogen related receptor (ERR), a nuclear receptor, is highly homologous with ER and can bind many kinds of estrogen response elements to share the signaling pathway with ER. At present, the function of ERR and its related signaling pathway on the ovarian development are poorly studied in crustacean. Based on our preliminary study, the ERR signaling pathway genes that can regulate the ovarian development of swimming crab, Portunus trituberculatus, will be screened via transcriptomics and chromatin immunoprecipitation, and then to confirm the relationship between the ERR and target genes by gene over-expression, RNA interference and cell transfection experiment. Finally, the functional mechanism of ERR signaling pathway target genes on ovarian development will be investigated through in vivo and in vitro experiment. This project takes a lead in studying the function of ERR signaling pathway on ovarian development and will lay the foundation for fully understanding the molecular mechanism of ovarian development. Meanwhile, The results will provide new scientific basis for mature induction in crustacean. Therefore, this project is of great theoretical and applicable importance.

雌激素是调控甲壳动物卵巢发育的重要性类固醇激素。在脊椎动物中，雌激素需要结合其受体来激活下游应答基因，但在甲壳动物中尚无雌激素受体 (ER) 基因的报道，这表明可能存在其它受体参与了甲壳动物雌激素的调控作用。雌激素相关受体 (ERR) 是一类和ER高度同源的核受体，能够结合雌激素应答原件，共享ER信号通路。目前关于ERR信号通路在甲壳动物卵巢发育中的研究甚少。本项目在现有结果基础上，通过转录组学和染色质免疫沉淀技术筛选可能参与三疣梭子蟹卵巢发育的ERR信号通路基因；采用过表达、RNA干扰以及细胞转染技术对该通路基因进行鉴定；最后通过活体和离体实验验证ERR信号通路基因在卵巢发育中的功能，并探究其机制。本项目率先开展了ERR信号通路在甲壳动物卵巢发育中功能的研究，为进一步明确三疣梭子蟹卵巢发育的分子机制奠定基础，同时还可为甲壳动物促熟技术的创新提供科学依据，具有重要理论意义和潜在应用价值。

作为一类重要的核受体，雌激素相关受体(ERR)在生物体的繁殖和发育等多种生物过程中起重要作用，但目前有关于其在甲壳动物中的研究较少。本项目首先较系统的研究了ERR在三疣梭子蟹卵巢发育过程中的功能，随后通过转录组技术分析了外源雌二醇对三疣梭子蟹卵巢、肝胰腺、脑神经节，眼柄和大颚器中卵巢发育相关基因表达的影响，最后在活体条件下研究了雌二醇及其拮抗剂对三疣梭子蟹卵巢发育过程中脂质代谢的影响。结果表明，1. PtERR基因在三疣梭子蟹的各组织中均有表达，尤其是在卵巢中表达量最高。在整个卵巢发育期间，卵巢中PtERR mRNA的表达水平在III期达到峰值。活体干扰结果显示：PtERR干扰后，雌体的卵巢指数，肝胰腺指数和肝胰腺中PtVg的转录均显著降低。激素响应结果显示在离体条件下雌二醇对不同卵黄发生阶段卵巢和肝胰腺中PtERR和PtVg的作用模式不同。此外，启动子分析发现在PtVg的启动子上存在4个1/2 ERE。2. 转录组分析显示雌二醇处理后三疣梭子蟹的卵巢，肝胰腺，脑神经节，眼柄和大颚器中分别产生316、1300、669、142和383个差异基因。富集分析显示差异基因主要富集到蛋白质的消化和吸收，胰腺分泌，昆虫激素的生物合成，药物代谢-细胞色素P450和信号转导路径上。雌二醇处理显著影响了一些与卵巢发育和营养代谢相关基因的表达，如卵黄膜外层1样蛋白，热休克蛋白70，Wnt5，JHE样羧酸酯酶1，细胞色素P302a1，甲壳动物高血糖激素，神经肽F2，胰蛋白酶，羧肽酶B，胰腺甘油三脂脂酶和脂滴蛋白。3. 在活体状态下，雌二醇及其拮抗剂(他莫昔芬)可显著改变三疣梭子蟹肝胰腺中脂质代谢相关基因，脂质组成及其组织结构的变化.例如二醇可促进三疣梭子蟹肝胰腺的脂质分解代谢而他莫昔芬会损害肝胰腺的组织学结构，并导致其脂质沉积的减少。本项目的研究结果进一步明确了雌激素相关受体调控三疣梭子蟹卵巢发育的分子机制，同时还为甲壳动物的生殖生理机制提供基础资料。