保幼激素信号通路基因在三疣梭子蟹卵巢发育中的功能探究

The methyl farnesoate (MF) is the unepoxidized precursor of juvenile hormone III (JH III), and plays essential roles in many physiological processes during the development of crustaceans. However, the signaling transduction system of MF is not well studied. Our group has elucidated the role of MF in the ovarian development of the swimming crab Portunus trituberculatus, and we also find that the JH receptor Met and a JH early-responsive gene Kr-h1 may be involved in the MF signaling transduction, and participate in the regulation of ovarian development. This project will further clone the cDNA of the Met molecular patterner SRC and analyze its expression pattern. The relationship between gene expression and MF will be studied by detecting the hormone titers in parallel to the in vitro and in vivo assays. A transcriptomic analysis will be utilized to screen the MF responsive genes which are involved in the ovarian development. RNAi will be applied to assess the loss effect of Met, SRC, and Kr-h1 on the gene expression of screened genes, Vg levels, and the ovarian development. In addition, by comparing the above effects to that of the addition and loss of MF (RNAi of JHAMT, the key enzyme in MF biosynthesis), we aim to illustrate the role of JH pathway genes in the signaling transduction process of crustacean MF, and to explore their functions during the ovarian development. To carry out this study will not only help to improve our understandings on the molecular mechanisms of crustacean MF actions, but also provide theoretical guidance for the artificial regulation of ovarian development of P. trituberculatus.

甲基法尼酯（MF）是昆虫保幼激素III（JH III）的非环氧化前体，参与调控甲壳动物生长发育的各项生理活动，但其作用的分子机制尚不清楚。课题组在阐明MF对三疣梭子蟹卵巢发育生理作用的过程中发现，JH分子受体Met和JH早期响应基因Kr-h1可能参与MF信号转导，并调控卵巢发育。本项目拟进一步对Met的分子伴侣SRC进行克隆和表达分析；通过激素测定和离体、活体实验分析MF与Met、SRC和Kr-h1等JH信号通路基因表达的关系，并利用转录组学筛选与卵巢发育相关的MF响应基因；通过RNAi分析Met、SRC和Kr-h1对下游基因表达、Vg水平及卵巢发育的影响，并与添加和减少MF后的情况进行比较，明确JH信号通路基因在MF信号转导中的作用，分析它们在卵巢发育中的功能。本项研究的开展，将有助于完善甲壳动物MF的分子作用机制，为实现三疣梭子蟹卵巢发育的人工调控提供理论指导。

甲基法尼酯（MF）是昆虫保幼激素III（JH III）的非环氧化前体，参与调控甲壳动物的多项生理过程。在已明确MF处理能够诱导三疣梭子蟹Met、Kr-h1等JH信号通路基因和卵黄蛋白原（Vg）基因表达的基础上，本项目利用RNA干扰技术分析了Met、Kr-h1对于Vg的调控作用，发现分别干扰Met和Kr-h1的表达均能够显著下调肝胰腺和卵巢外植体中Vg的表达水平，且添加MF后无法挽救下调效果，表明JH信号通路基因Met和Kr-h1同样参与MF调控卵巢发育的信号转导。此外，干扰Met的表达能够下调Kr-h1的表达并减轻MF对于Kr-h1的诱导作用，再次证明Met可能也是甲壳动物MF的分子受体，并在其信号转导中扮演了重要角色。利用RACE技术克隆了JH信号通路中的另一重要基因E93的全长cDNA，并通过离体条件下的激素处理实验发现，添加蜕皮激素（20E）能够诱导肝胰腺、卵巢和Y器中E93的表达，而添加MF则对3个组织中E93的表达存在抑制作用，预示着E93可能参与MF和20E的信号交流；进一步的RNA干扰实验发现，E93对于卵巢和肝胰腺中Vg表达存在相反的调控模式，且对于Y器中蜕皮激素的合成具有重要作用，这反应了MF既可直接作用于卵巢、肝胰腺，也可间接的通过调控蜕皮激素的合成调节卵巢发育。为进一步揭示MF调控卵巢发育的下游通路，对MF处理前后的肝胰腺及卵巢进行了转录组学分析，鉴定了大量差异表达基因及它们的GO、KEGG的分类富集信息；同时通过神经系统的转录组学分析，鉴定得到了47条三疣梭子蟹神经肽和47种GPCR受体，这些组学信息为进一步完善卵巢发育的分子调控网络提供了有效的数据支持。此外，项目还首次在甲壳动物中发现了CYP15A1、JHEH等JH III合成、降解的关键酶基因，并制备了CYP15A1的重组蛋白和多克隆抗体，通过添加JH III的离体实验结果，课题组推测JH III可能也存在于甲壳动物中，但缺乏生物活性，可能作为中间产物参与MF的降解过程。上述结果不仅有助于进一步完善甲壳动物的内分泌调控理论，也将为三疣梭子蟹性腺发育人工调控技术的建立提供理论指导。