荧光蛋白生色团成熟机理的理论研究

Green fluorescent proteins (GFPs) are particularly useful not only due to the fluorescence they can display, but also to their stabilities and the fact that the chromophores are formed in an autocatalytic cyclization of a peptide from their own backbone structure that does not require a cofactor. Understanding of the mechanism of the autocatalytic post-translation reaction of GFP will be beneficial in designing brighter and faster mutants, thereby increasing their utility in biotechnology and cell biology. Our studies involves three aspects: First, investigating the mechanism of chromophore maturation in GFP. The chromophore maturation process in GFP comprises three steps, which is cyclization, oxidation and dehydration. The mechanism of these three stpes will be explored. Second, mature GFP is most efficiently formed at temperatures well below 37 ℃. This has limited the uses of GFP, especially in mammalian cells, and leading to search for GFP mutants that mature more efficiently at higher temperatures. Some mutants can improve chromophore maturation efficiency, these structure-activity relationship will be studied. Third, the red-emitting FPs (RFPs) are of particular importance as suitable marker for mammalian deep tissue imaging. Most of the RFPs share a DeRed-like chromophore, and the mechanism of DsRed -like chromophore maturation process will be investigated. Molecular dynamics (MD),density functional theory (DFT) and combined quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) methods will be used to investigate the above problems.

绿色荧光蛋白不仅能够发出稳定的荧光，而且其生色团的成熟是一个自催化的过程，不需要任何的辅因子。因此，绿色荧光蛋白生色团的成熟机理不仅是一个重要而有趣的理论问题，还可以帮助人们合成出成熟速率更快、荧光更稳定、颜色更亮的荧光蛋白变体，具有广泛的应用价值。本研究主要包括三个方面：1）探索出野生型绿色荧光蛋白生色团成熟机理完整的图像。成熟机理主要包括三个步骤，环化-氧化-脱水，本研究将对这三个步骤的具体机理给出清晰的图像。2）之前的研究表明有些变体能够加快绿色荧光蛋白生色团的成熟速率，本研究将对绿色荧光蛋白生色团成熟机理中的构效关系做进一步研究。3)指明红色荧光蛋白DsRed生色团的成熟机理。本研究主要利用分子动力学（MD）、密度泛函理论（DFT）和量子力学/分子力学（QM/MM）相结合的方法,来解决上述问题。

本项目采用DFT和QM/MM的方法研究了野生型绿色荧光蛋白（wild-type GFP）生色团成熟过程中的环化机理、氧化机理及脱水机理。我们第一次给出了wild-type GFP生色团成熟机理的完整图像。研究表明环化反应是分步进行的，即存在一个质子化的酰胺化合物中间体，这个质子化的酰胺化合物可以通过与晶体水分子形成氢键而稳定存在。计算结果表明Glu222夺去Tyr66 α-碳上的质子是氧化过程的速率控制步骤，也是wild-type GFP生色团成熟过程中的速率控制步骤。优化得到了氧化反应的产物结构，这个结构与实验上得到的晶体结构是一致的。该氧化反应产物相对于反应物能量为–48.7 kcal/mol，这进一步证实了在生成了热力学不稳定的环化产物后紧接着发生的是氧化反应，从而使整个反应朝着有利于生色团成熟的方向进行。因此，我们的计算结果对实验上关于第二步反应是氧化还是脱水这个长期争论的问题给出了答案。我们在已经成熟的wild-type GFP晶体结构的基础上，创造性地通过研究脱水反应的逆反应机理来了解脱水反应机理，结果表明Tyr66 β-碳上的质子转移到Arg96上的过程是脱水反应的速率控制步骤，这一结论与实验上观测到的结果是一致的。通过研究wild-type GFP生色团成熟过程的具体机理，分析了该机理中的构效关系，指明了一些氨基酸残基在生色团成熟过程中的作用。我们的研究为设计出生色团成熟速率更快的荧光蛋白变体奠定了基础，并为认识其他颜色荧光蛋白生色团的成熟机理指明了方向。