二化螟神经酰胺代谢酶生化特征及生理功能研究

昆虫的生态对策即昆虫的发育、生殖和存活在它们的扩散、分布及种群发生动态中起着至关重要的作用。我们前期研究发现：碱性神经酰胺酶通过调控神经酰胺水平在果蝇的发育、生殖和存活中发挥重要的生理作用，在此基础上，我们提出神经酰胺酶和鞘磷脂酶能够调控水稻重要害虫二化螟体内神经酰胺水平，并协同调节活性氧、蜕皮激素、保幼激素水平，进而在二化螟的发育和存活过程中发挥重要作用的设想。本项目结合模式生物中相关研究成果，通过对二化螟神经酰胺代谢酶的生化特征的描述，酶活力降低后二化螟发育、存活的种群生态学研究，以及对二化螟体内神经酰胺水平、蜕皮激素和保幼激素含量、活性氧水平的生化分析，证实上述设想的正确性，揭示神经酰胺酶和鞘磷脂酶调节昆虫发育、存活的机理，拓展昆虫鞘脂质代谢研究领域，寻找鳞翅目昆虫特有的化合物作用靶标以应对其生态对策，为害虫的种群控制、动态及发生趋势预测等综合治理措施提供理论和实践依据。

碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶是生物体内调节鞘脂质代谢的重要酶类，它们能否调控水稻重要害虫二化螟体内神经酰胺水平，并协同蜕皮激素等在二化螟的发育过程中发挥重要作用还未知。本项目以二化螟为研究对象，分析其碱性神经酰胺酶、中性鞘磷脂酶生化特征，并探索它们在二化螟体内可能的生理功能。以下是主要研究结果: 1. 克隆二化螟碱性神经酰胺酶基因saCER。saCER基因蛋白产物与果蝇、人类、小鼠的碱性神经酰胺酶序列具有较高的同源性。生物信息学分析预测：saCER基因存在7个跨膜区，saCER蛋白存在于细胞质中并主要定位于质膜和内质网上。saCER-GFP重组质粒在sf9细胞中表达分析显示：saCER主要分布在细胞膜上。saCER体外表达时，在pH9条件下表现出最高酶活力，表明saCER在碱性环境下具有最佳酶活力。随着二化螟从幼虫发育到成虫的发育进展，saCER mRNA的表达水平也不断升高。saCER在二化螟的胸部和足部有最高的表达量，这表明saCER可能参与二化螟蜕皮激素水平的调控并且可能在肌肉系统中发挥重要的生理功能。2. 克隆二化螟中性鞘磷脂酶基因snSMase。snSMase蛋白序列与家蚕等其它昆虫和哺乳动物的中性鞘磷脂酶具有较高同源性。生物信息学分析显示，snSMase基因只存在1个潜在跨膜区，在N端和H区域分别存在1个信号肽序列，89%的snSMase蛋存在于细胞质中并平均分布于内质网、高尔基体和线粒体和质膜上，表明snSMase基因所编码的蛋白是也一个膜蛋白。snSMase体外表达时，在pH7条件下表现出最高酶活力，说明saCER在中性环境下具有最佳酶活力。snSMase的表达水平也随幼虫到成虫的发育不断升高，结合之前saCER mRNA在不同发育阶段的表达水平，我们得出：神经酰胺，同时作为鞘脂类代谢通路中saCER的上游底物和snSMase的下游产物，在二化螟的完全变态发育中发挥一定的生理作用。snSMase在二化螟胸部和卵巢中的表达量显著高于其它组织器官，表明snSMase可能在雌虫的生殖过程中发挥重要的作用，且神经酰胺可能参与调控二化螟体内蜕皮激素的水平。本项目鉴定了saCER基因产物为二化螟碱性神经酰胺酶、snSMase为二化螟中性神经酰胺酶，并证明它们在二化螟的发育和神经酰胺代谢过程中具有一定的生理功能，揭示了神经酰胺酶和鞘磷脂酶调节昆虫发育的潜在机制。