离子束辐照对水稻错配修复基因的作用及其与点突变的关系

本项目拟利用近年来新发现的可以特异性识别和切割错配碱基的芹菜核酸酶CEL I，结合接头连接和特异性扩增，建立一种简便、有效、不经测序即可确定突变位点和碱基的点突变检测新技术；对水稻错配修复基因的自然变异进行分析，评价水稻错配修复基因的遗传多样性；以水稻DNA错配修复基因的逆转座子插入突变系及其对照为材料，通过对点突变的检测与分析，明确氮离子束辐照诱发点突变的特点；通过对不同错配修复基因的表达与诱变分析，探讨离子束辐照对错配修复基因的作用及其与点突变发生的关系。本研究结果不但可以为离子束诱发突变的筛选提供简便、快速和有效的新方法，提高离子束诱发突变的检测效率，而且对于阐明离子束辐照与DNA损伤修复系统的相互作用和揭示离子束诱发突变的机理有也具有重要的意义。

错配修复主要负责单个及少数碱基的缺失、插入及错配的修复。对点突变的研究有助于深入认识高等生物的遗传特性和揭示突变发生机理，对功能基因组学研究和建立分子标记也具有重要意义。通过生物信息学的手段在水稻基因组中已鉴定出涉及到错配修复途径的基因，但迄今对这类基因在水稻中的功能、多样性及其突变体对诱变处理的反应尚缺乏了解。为此，本项目探讨了离子束离子束辐照对水稻错配修复基因的作用及其与点突变的关系。利用芹菜核酸酶CEL I可以特异性识别和切割错配碱基的特性，结合接头连接和特异性扩增，我们建立了一种不经测序即可确定突变位点和碱基的点突变检测新技术。对OsMsh6(LOC_Os09g24220)和Muts（LOC_Os10g36530）基因的SNP分析结果表明，与日本晴相比，其它材料在MSH6基因的2334-3433 bp区段内存在8个SNP, 在Muts基因的416-1501bp区段内则有2个SNP。在192份水稻微核心资源中OsMsh6的SNP发生频率为12.5%（24/192），Muts基因的SNP发生频率为28.13%（54/192）。对突变体ND6011、NF7784、NF9010及其对照日本晴种子进行了辐照处理（注入剂量分别为1000、3000 和5000 次，每次流量为2.6×1015 N+/cm），M1代苗期生理指标测定结果显示，突变体对离子束辐照的敏感性增强，特别是在高剂量下。RT-PCR分析结果表明，OsMsh6表达水平显著增高。因此，推测OsMsh6基因参与了离子束辐照引起DNA损伤的修复。在M2代出现了多种表型突变，如叶色、叶宽、分蘖数、株高、成熟期、育性等，3个突变体的突变频率明显高于日本晴，平均提高4-7倍。SLAF测序结果也显示，在3000次脉冲处理剂量下突变体NF9010基因组中的点突变频率是日本晴的3倍。这些结果一方面证明了Msh6基因确实参与了离子束诱发DNA损伤的修复，另一方面也揭示了错配修复基因在离子束辐照与点突变发生中的“桥梁”作用。本研究结果对阐明离子束诱发点突变的特性与机理和利用错配修复突变体构建高效的诱变育种体系具有重要意义。